HPLC-DAD法同时测定理冲生髓饮中7种亲脂性成分

王艳宏， 尚冬雪， 李 洋， 赵永伟， 张 艳， 韩凤娟*

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨150040）

［质 量］

HPLC-DAD法同时测定理冲生髓饮中7种亲脂性成分

王艳宏1， 尚冬雪1， 李 洋1， 赵永伟1， 张 艳2， 韩凤娟2*

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨150040）

目的建立RP-HPLC法同时测定理冲生髓饮中亲脂性成分的分析方法。方法理冲生髓饮超临界萃取，HPLC法分析采用Dikma Diamonsi1-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以0.1%磷酸水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱，体积流量为1 mL/min，检测波长210 nm。结果姜黄素、莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、亚油酸、β-榄香烯分别在0.16～8.14μg/mL、0.27～13.44μg/mL、0.10～4.98μg/mL、0.18～9.10μg/mL、0.08～4.06μg/mL、0.21～10.59μg/mL、0.28～14.18μg/m L范围内线性关系良好。平均加样回收率在96.76%～100.38%之间。结论本方法能够准确测定理冲生髓饮7种亲脂性成分。

理冲生髓饮；姜黄素；莪术醇；牻牛儿酮；莪术二酮；呋喃二烯；β-榄香烯；亚油酸

理冲生髓饮是国家老中医、黑龙江省名中医王秀霞教授在长期临床实践基础上总结而成的中药复方制剂，由莪术、三棱、黄芪、鹿茸等八味中药组成，具破血消癥、软坚散结、补气养血、填精益髓之功，对卵巢癌的治疗有独特的疗效［1］。现代实验研究表明其既可以阻断Bc1-2癌基因蛋白的表达［2］，又能够降低卵巢肿瘤细胞的PCNA和P53基因的表达［3］，通过调节癌基因信号传导，抑制细胞增殖［4］，进而抑制血管生成，在提高机体免疫的同时，促进癌细胞凋亡［5-7］。姜黄素、莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、β-榄香烯是莪术的主要成分，具有消炎、抗血栓、抗肿瘤、抗菌抗病毒等多种药理活性［8-12］。亚油酸是黄芪、鹿茸等均含有的成分，不仅对血管及血液中引起动脉粥样硬化、血稠和栓塞的物质具有重要影响，而且还具有抗癌作用［13］。为了更好地控制产品质量，保证临床疗效，本实验采用HPLC-DAD法对该制剂中的上述7种亲脂性成分进行了定量测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪，2996型二极管矩阵检测器，Empower工作站（美国Waters公司）；AB265-S型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；CHA121-50-01超临界萃取装置（南通华安超临界萃取有限公司）；FW177中草药粉碎机 （天津泰斯特仪器有限公司）；GZX-9240型数显鼓风干燥箱 （上海博迅医疗设备厂）。

1.2 试药 对照品姜黄素 （批号 110823-201004），莪术二酮 （批号111800-201001），莪术醇 （批号100185-201007），牻牛儿酮 （吉马酮）（批号111665-201204），呋喃二烯 （批号111824-201102），亚油酸 （批号111622-201203），β-榄香烯 （批号100268-201402），均购自中国药品生物制品检定所。无水乙醇、磷酸 （分析纯，天津富宇精细化工），乙腈（色谱纯，美国Sigma-A1drich公司），屈臣氏蒸馏水。复方理冲生髓饮方中各药由黑龙江中医药大学附属第一医院提供，经黑龙江中医药大学孙慧峰教授鉴定均符合 《中国药典》2010年版各项下药材规定。

2 方法与结果

2.1 理冲生髓饮的制备 取处方量的药材，适当粉碎，以超临界萃取 （SCFE）法萃取，获得萃取物；药渣继续以75%乙醇回流提取，提取液回收乙醇后浓缩至适量；药渣挥尽溶剂后，继续以水回流提取，水提液浓缩后，与上述浓缩液合并，加入萃取物，搅匀，即得。

2.2 供试品溶液的制备 精密吸取理冲生髓饮适量，减压旋干溶剂后，加无水乙醇超声溶解，并定容至50 mL量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 混合对照品溶液的制备 分别取对照品姜黄素、莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、亚油酸、β-榄香烯适量，精密称定，加无水乙醇分别制成每1 mL含姜黄素407.0μg、莪术二酮672.0 μg、莪术醇248.8μg、牻牛儿酮455.2μg、呋喃二烯203.0μg、亚油酸529.5μg、β-榄香烯709.0 μg的溶液作为各对照品贮备液，再分别吸取各对照品贮备液5.0 mL置50 mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度作为对照品混合溶液。

2.4 阴性对照液的制备 按 “2.1”项理冲生髓饮的制备方法分别制备缺莪术、缺黄芪、鹿茸的样品；按 “2.2”项供试品溶液的制法制备阴性对照液。

2.5 色谱条件 色谱柱为Dikma Diamonsi1-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为0.1%磷酸水溶液 （A）-乙腈 （B）梯度洗脱 （0～15 min，45%→60%B；15～25 min，60%→70%B；25～35 min，70%B；35～50 min，70%→88%B；50～58 min，88%→90%B；58～68 min，90%→95%B；68～75 min，95%→100%B）。柱温30℃，体积流量1 m L/min，进样量10μL，检测波长210 nm。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系的考察 按逐级稀释法，分别精密吸取上述对照品混合溶液0.1、0.5、1、3、5 mL于25 mL量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，得混合对照品系列溶液，按 “2.5”项下色谱条件进行测定，以峰面积 （Y）对质量浓度 （X）进行线性回归，得到7种成分的回归方程分别为Y= 7 977.5X+5 038，r=0.999 7；Y=1 310.8X+ 14 055，r=0.999 7；Y=3 714.4X+20 810，r= 0.999 5；Y=8 327.2X+9 517.5，r=0.999 6；Y=28 336X+22 994，r=0.999 8；Y=19 224X+ 27 857，r=0.998 5；Y=7 270.4X+2 423.5，r= 0.999 5。姜黄素、莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、亚油酸、β-榄香烯分别在0.16～8.14 μg/mL、0.27～13.44μg/m L、0.10～4.98 μg/mL、0.18～9.10μg/mL、0.08～4.06μg/mL、0.21～10.59μg/mL、0.28～14.18μg/m L范围内线性关系良好。

2.6.2 系统适应性 取阴性对照液、混合对照品溶液和供试品溶液，按 “2.5”项下色谱条件测定，各对照品色谱峰与其左右干扰峰分离度在1.5～5.3之间，姜黄素、莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、亚油酸、β-榄香烯的保留时间分别为8.359、17.208、24.694、29.899、44.328、 51.314、58.622 min，理论塔板数均大于7 000，如图1所示。

图1 理冲生髓饮HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram s of Lichong Shengsui Drink

2.6.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，重复进样6次，每次进样10μL，测得姜黄素、莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、亚油酸、β-榄香烯的峰面积，其RSD分别为0.54%、0.48%、0.63%、0.77%、0.87%、0.95% 和0.69%，表明仪器精密度良好。

2.6.4 稳定性试验 取已配制好同一供试品溶液，分别于配制后的0、2、4、8、12、24 h注入色谱仪，计算各组分色谱峰的峰面积RSD，测得姜黄素、莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、亚油酸、β-榄香烯的RSD值分别为1.05%、0.99%、1.31%、1.18%、1.43%、1.42%和1.08%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6.5 重复性试验 精密吸取理冲生髓饮适量，按 “2.2”项下方法制备供试品溶液，按 “2.5”项色谱条件测定，进行6次平行试验，结果姜黄素、莪术二酮、莪术醇、牻牛儿酮、呋喃二烯、亚油酸、β-榄香烯的质量分数的RSD值分别为1.83%、 1.91%、 1.69%、 1.77%、 1.95%、1.83%和1.76%，表明方法重复性良好。

2.6.6 加样回收率试验 精密吸取已知各成分含有量的理冲生髓饮10 m L 9份，按其中所含各成分的80%、100%和120%质量分别精密加入对照品混合溶液0.8、1.0、1.2 mL，按 “2.2”项下方法制备成供试品溶液，按 “2.5”项下色谱条件分别测定。结果见表1～7。

表1 姜黄素加样回收率Tab.1 Resu lts of recovery tests for curcum in

2.7 样品测定 精密吸取3份不同批供试品溶液，按 “2.5”项下色谱条件分别测定，将峰面积带入上述线性回归方程计算，得各组分质量分数，见表8。

表2 莪术二酮加样回收率Tab.2 Results of recovery tests for curdione

表3 莪术醇加样回收率Tab.3 Results of recovery tests for curcumol

表4 牻牛儿酮加样回收率Tab.4 Resu lts of recovery tests for germacrone

表5 呋喃二烯加样回收率Tab.5 Results of recovery tests for furanodiene

表6 亚油酸加样回收率Tab.6 Results of recovery tests for linoleic acid

表7 β-榄香烯加样回收率Tab.7 Results of recovery tests forβ-elem ene

表8 理冲生髓饮中7种成分的测定结果Tab.8 Determ ination of seven constituents in Lichong Shengsui D rink

3 讨论

中药制剂质量控制的模式正由单指标向多指标，由单成分向大类成分 （有效部位）质量控制模式转变。理冲生髓饮中的挥发油类、皂苷类、黄酮类、多糖类成分等均为其治疗卵巢癌的物质基础［8-13］。我们试图建立一种能够同时测定这些类成分的高效液相分析方法，但由于这些成分理化性质差异较大，供试品溶液的制备、流动相的组成、检测器的要求等很难统一，因此，只能分别建立定量测定方法。

本实验分别对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液及乙腈-0.1%醋酸水溶液系统梯度洗脱的分离效果进行了考察，结果发现，甲醇-水与乙腈-水系统严重拖尾，分离效果较差；而乙腈-0.1%甲酸水溶液与乙腈-0.1%醋酸水溶液紫外末端吸收较大，基线漂移，影响色谱图检识；乙腈-0.1%磷酸水溶液能够将各组分分离，且峰形较好，基线平稳，因而选择乙腈-0.1%磷酸水溶液系统进行梯度洗脱。

本实验采用二极管阵列检测器在190～400 nm范围内全波长扫描，对203 nm、210 nm、216 nm和220 nm波长下的色谱图进行分析比较，结果显示，供试品在210 nm处能够将各组分检出，且各峰之间分离度较好，因此选择210 nm作为检测波长。

本实验所建立的方法简单、准确、可靠，可同时测定理冲生髓饮中姜黄素、莪术醇、牻牛儿酮、莪术二酮、呋喃二烯、β-榄香烯及亚油酸等7种亲脂性成分，从而为理冲生髓饮的质量标准的制定提供了依据，并为该方进一步开展治疗卵巢癌药效物质基础及作用机制研究奠定了基础。

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Sim ultaneous determ ination of seven lipophilic constituents in Lichong Shengsui Drink by HPLC-DAD

WANG Yan-hong1， SHANG Dong-xue1， LI Yang1， ZHAO Yong-wei1， ZHANG Yan2，HAN Feng-juan2*
（1.Heilongjiang University ofChineseMedicine，Harbin 150040，China；2.FirstAffiliated Hosital，Heilongjiang University of ChineseMedicine，Harbin 150040，China）

AIMTo estab1ish an HPLC-DAD method for simu1taneous1y determining the contents of curcumin，curcumo1，cermacrone，curdione，furanodiene，β-e1emene and 1ino1eic acid in Lichong Shengsui Drink（LCSSD）.METHODSHPLC ana1ysis of LCSSD methano1ic extract was performed on Dikma Diamonsi1-C18（250 mm×4.6mm，5μm）co1umn with themobi1e phase of0.1%phosphoric acid aqueous so1ution as phase A and acetonitri1e as phase B in gradient e1ution manner.The vo1umetric f1ow rate was 1 mL/min and the detection wave1ength was set at210 nm.RESULTSEvery constituentwas separated perfect1y and good 1iner re1ationships between peak area and mass concentration were obtained in the ranges of 0.16-8.14μg/mL，0.27-13.44 μg/mL，0.10-4.98μg/mL，0.18-9.10μg/mL，0.08-4.06μg/mL，0.21-10.59μg/mL and 0.28-14.18μg/mL，respective1y.The average recovery ratewaswithin the ranges of96.76%-100.38%.CONCLUSIONThismethod is accurate and re1iab1e for the determination of above-mentioned seven 1ipophi1ic constituents in LCSSD.

Lichong Shengsui Drink（LCSSD）；curcumin；curcumo1；curdione；germacrone；furanodiene；β-e1emene；1ino1eic acid

R927.2

A

1001-1528（2015）08-1713-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.017

2014-10-30

国家自然科学基金项目 （81273788）

王艳宏（1972—），女，教授，硕士生导师，从事中药性味理论和中药制剂现代化研究。E-mai1：wang.yanhong@163.com

*通信作者：韩凤娟 （1971—），女，教授，博士生导师，主要从事中西医结合诊治妇科肿瘤研究。E-mai1：hanfengjuan2004@163.com