益生菌发酵对大黄抑制大肠杆菌的影响

■韩佳慧 郭云霞 李 晔 徐大庆 吴国江 郝庆红 魏 萌

（河北农业大学生命科学学院，河北保定 071001）

近年来，我国的养殖规模在不断扩大，同时养殖环境也在日益恶化，动物腹泻性疾病在实际生产中时常发生，养殖户为了达到防病、治病的目的，在养殖业上滥用抗生素的现象普遍存在[1-2]，抗生素的使用虽然提高了生产效益，但是长期使用抗生素导致抗生素药物有不同程度的残留，从而严重影响人们的身体健康。现在世界各国都在逐步的取消抗生素饲料添加剂，因此寻找绿色饲料添加剂来代替抗生素是急需解决的问题。

中草药是我国五千年文明历史传承下来的文化遗产，在疾病防治史中占据重要地位[3-4]，而且与抗生素相比，其拥有低毒、副作用小、安全、有效等特点，越来越受到人们的青睐。例如发生大肠埃希菌、沙门菌等病原菌感染时，金银花、黄连、蒲公英、白头翁等中草药拥有很好的抗菌作用，疗效显著[5]。大黄作为我国的传统中药材之一，主要含大黄酸、大黄多糖、大黄酚、大黄素等，其药理作用国内外研究广泛，主要有抗肿瘤、活血、清除自由基、抑菌抗炎等作用[6-8]。大黄成分较多，但其炮制方法不同，就可能导致其有效成分的不同，甚至影响其药理作用和临床效果[9]。李国旺等利用浸提的方法从大黄中提取有效成分，结果显示大黄对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等均有一定的抑菌作用[7]。益生菌作为人体肠道中的一种有益菌能够调解肠道菌群，使肠道菌群达到平衡[10]。而有关益生菌发酵对大黄体外抑菌作用的影响尚未见报道。

1 试验材料与方法

1.1 材料

菌种：大肠杆菌(E.Coli)、益生菌N-14，均由河北农业大学制药工程实验室提供。

试验原料：大黄（购自河北省安国市中药材市场）、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠等。

仪器：752型紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司制造）；SPX智能型生化培养箱（宁波江南仪器厂）；HPX-9052MBE电热恒温培养箱（上海博迅实验有限公司医疗设备厂）；BCD-649WE低温冰箱（青岛海尔股份有限公司）；ZHWY-2112B型双层摇床（上海智城分析仪器有限公司）；BCD-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海飞越实验仪器有限公司）；MLS-3020高压灭菌锅（SANYO公司）；EN1535型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化

用竹签分别挑取斜面保存的N-14益生菌、大肠杆菌，接种于NB培养基，37℃摇床培养活化24 h，培养液在4 ℃离心，12 000 r/min，5 min，取上清液用0.2 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.2.2 大黄提取液的制备

将大黄粉碎60目过筛。称取大黄粉末50 g，加一定量水浸泡1 h，然后于煎锅中煮沸，再文火持续煎制30 min，过滤，滤渣同法再进行两次煎煮，合并滤液离心，5 000 r/min，10 min，旋转浓缩至50 ml（浓度相当于1.0 g/ml），紫外灭菌，4℃冰箱备用。

1.2.3 接种量对发酵大黄抑菌性的影响

取20 ml大黄煎制液，加入6 g无机盐，紫外灭菌20 min，然后分别接入1%、2%、3%、4%、5%的N-14，pH值7，37℃摇床培养24 h，测定发酵大黄对大肠杆菌的抑菌性。

1.2.4 pH值对发酵大黄抑菌性的影响

其他条件相同情况下，在pH值分别为5、6、7、8、9时培养，测定发酵大黄对大肠杆菌的抑菌性。

1.2.5 盐浓度对发酵大黄抑菌性的影响

其他条件相同情况下，然后分别加入3、4、5、6、7 g的硫酸镁，测定发酵大黄对大肠杆菌的抑菌性。

1.2.6 发酵时间对发酵大黄抑菌性的影响

其他条件相同情况下，分别培养9、12、18、24 h和36 h，测定发酵大黄对大肠杆菌的抑菌性。

1.2.7 发酵温度对发酵大黄抑菌性的影响

其他条件相同情况下，分别在 35、37、39、41、43℃时培养，测定发酵大黄对大肠杆菌的抑菌性。

2 结果与分析

2.1 接种量对发酵大黄抑菌性的影响

不同接种量对发酵大黄抑菌性的影响见图1。由图1可知，接种量为1%、2%、3%时抑菌性增强了，当接种量为4%、5%时抑菌性又下降了。由于 2%、3%时抑菌性相同，这说明接种量为2%时发酵大黄对大肠杆菌的抑菌性最强。

图1 接种量对发酵大黄抑菌性的影响

2.2 pH值对发酵大黄抑菌性的影响

pH值对发酵大黄抑菌性的影响如图2所示。由图2看出当pH值由5增至9时，抑菌性整体性是增强的，pH值为7时抑菌性达到最大，pH值为8、9时抑菌性趋于平缓，但略有下降。由此可见，当发酵pH值为7时，发酵大黄对大肠杆菌的抑菌性最强。

图2 pH值对发酵大黄抑菌性的影响

2.3 盐浓度对发酵大黄抑菌性的影响

不同盐的添加量对发酵大黄抑菌性的影响如图3所示，由图3可知盐的添加量由3 g增加到6 g时抑菌性是逐渐增强的，添加量为7 g时抑菌性又有所下降。结果表明，盐的添加量为6 g时，发酵大黄对大肠杆菌的抑菌性最强。

图3 盐浓度对发酵大黄抑菌性的影响

2.4 发酵时间对发酵大黄抑菌性的影响

发酵时间对发酵大黄抑菌性的影响如图4所示，由图4得知，发酵时间在6～24 h时，发酵大黄的抑菌性是逐渐增强的，到达30 h时，抑菌性又有所下降。由此可知，发酵大黄24 h，此时大黄对大肠杆菌的抑菌性最强。

图4 发酵时间对发酵大黄抑菌性的影响

2.5 发酵温度对发酵大黄抑菌性的影响

发酵温度对发酵大黄抑菌性的影响如图5所示，由图5可知，发酵温度开始升高时，抑菌性是增强的，当温度达到37℃时，抑菌性达到最大，39、41℃时趋于平缓，略有下降，43℃时下降较大。由此可知，发酵温度为37℃时，发酵大黄对大肠杆菌的抑菌性最强。

图5 发酵温度对发酵大黄抑菌性的影响

2.6 大黄发酵液对大肠杆菌抑菌效果

从图6和表1可以看出，N-14大黄发酵液对大肠杆菌抑菌圈直径为16.7 mm，未发酵大黄对大肠杆菌抑菌圈直径为11.0 mm。说明大黄发酵后N-14对大肠杆菌的抑菌性增强。

图6 抑菌活性测定结果

表1 抑菌圈直径

3 讨论

我国是世界上植物资源大国，中草药在我国的防病治病中占有重要地位。传统的中药提取主要是中药水煎或醇提法。四千多年前，我国人民就利用发酵技术来制作食品，后来又利用微生物来对天然产物进行发酵。中药发酵继承了传统的中药炮制法，利用现在微生态学的成果知识，结合现代微生物工程形成的中药制药新技术[11-12]。微生物在发酵中药时，可以产生一些能够分解转化物质能力的微生物，并能够产生一些次生代谢产物，如纤维素酶、木质素酶、淀粉酶、蛋白酶等，以消化植物的细胞壁，释放活性成分，提高中药有效成分含量，大分子物质降解为小分子物质，增强中药提取物的生物活性，降低药物毒性成分，节约药用资源，产生新的活性物质，最终扩大用药范围，增强药物的疗效[2，11]。

中药的发酵受多方面的影响：①温度是影响微生物生长的最重要因素之一，参与细胞内生化反应酶的活性与温度息息相关，温度较低或较高都会影响菌种的活性，从而导致有效成分提高率下降[13-14]；②接种量也是影响微生物发酵的重要因素，当接种量增大时，发酵速度会随之加快，但是接种量过大(超过3%时)菌种的繁殖和呼吸作用会加快，菌种用于呼吸及繁殖时就会消耗发酵培养基中的大量有效成分，不利于有效成分的积累[15]；③微生物的发酵时间也不是越长越好，发酵过程中产物高峰生产阶段时间越长，生产率也越高，到一定时间后产物产量会减缓下降[16]，除此之外，pH值、盐浓度、盐离子种类等也会影响中药的发酵，所以选择最佳条件发酵中药，使得中药达到最大的疗效。

我国的发酵技术虽然历史悠久，但中药益生菌发酵仍处于起步阶段，存在诸多问题，例如：单一菌种还是混合菌种的选择，单味中药和复方中药的选择，生物制品和创新药物的定位问题等。目前，我国已将中药发酵工程列为“十二五”计划，益生菌发酵中药定会取得长足的发展。

4 结论

通过利用益生菌N-14对大黄进行发酵，发酵大黄与水煎液大黄相比，对大肠杆菌的抑制作用大大增强，发酵条件为：pH值7，盐离子MgSO4为 6 g，接种量2%，温度37℃，时间24 h。此条件下发酵大黄对大肠杆菌的抑菌效果最好。