汗腺细胞在人体皮肤创伤及修复中的研究进展

陈甫寰宋慧锋王统民何秀叶综述，岳晓彤审校

（解放军医学院解放军总医院第一附属医院烧伤整形科北京100048）

·综述·

汗腺细胞在人体皮肤创伤及修复中的研究进展

陈甫寰宋慧锋王统民何秀叶综述，岳晓彤审校

（解放军医学院解放军总医院第一附属医院烧伤整形科北京100048）

汗腺作为人体最大的器官-皮肤重要的附属器，在人体中具有重要的作用。大面积重度烧创伤患者因其皮肤均为增生性瘢痕修复，大部分汗腺结构被破坏且无法再生，失去了通过汗液蒸发来调控体温这一基本功能，严重影响了患者的生存质量。组织工程技术的发展为大面积皮肤缺损修复提供了新的方法，并获得了一定疗效。文章首先借助于前言文献研究，介绍汗腺细胞的基本形态，功能等；其次，探究相关干细胞向汗腺细胞的分化进展研究，详细地介绍了表皮干细胞、间充质干细胞及毛囊干细胞向汗腺细胞的分化，以及其分化的通路MAPK，ERK等介绍；然后对汗腺细胞体外培养现状进行了阐述；最后研究分析了再生汗腺细胞用于皮肤创伤与修复。

汗腺；汗腺细胞；表皮干细胞；间充质干细胞；皮肤创伤；修复

汗腺作为皮肤的重要附属器官，在物质代谢、调节体温以及维持体液平衡等方面都具有重要作用。对于人体而言，当外界环境温度高于30℃时，传导、对流以及辐射等散热方式停止作用，通过汗腺细胞分泌汗液成为人体唯一的散热途径［5］。汗腺分为外泌汗腺和顶浆汗腺，即俗称的大汗腺和小汗腺。外泌汗腺可达数百万个，分布于人体除嘴唇、外耳道、阴蒂和阴唇的全身各处，以手掌和脚底处的皮肤最多［6-8］。有关实验研究发现，新生的汗腺细胞（Sweat Gland Cel ls，SGCs）在形态上多呈现圆形、锥体形、椭圆形或短柱状，当细胞生长密集时则多呈扁平的不规则多角形，并且中间会出现圆形核。各组织块长出的汗腺细胞汇合时，可观察到“铺路石”般的外观，局部可以观察到“穹窿”或“拉网”状等汗腺细胞生长的特征现象。而随着生长周期的延长，传代汗腺细胞在贴壁时呈现圆形，然后细胞逐步伸展，并且透明度增高，细胞形态也以椭圆形或短柱状为主［9］。

严重烧创伤患者残余的汗腺导管或者分泌部的细胞是皮肤创面自然愈合的修复细胞之一，这种作用也已经达到一种共识。在汗腺中分离出来的多能或者单能干细胞可以促进皮肤创面愈合，其作用主要还是形成汗腺［10］；在深Ⅱ度烧伤创面，汗腺分泌部的单层上皮细胞可以逆分化为表皮干细胞［11］；为比网状层深处的创口提供修复细胞（毛囊隆突部已经受损）。这个过程很缓慢，正因为这一点导致肉芽组织和瘢痕的形成。

1　汗腺细胞的体外培养研究

有关细胞和组织的传统研究方法主要采用二维培养模式获得细胞［12］，但是二维培养的细胞难以很好地模拟体内细胞微环境，也难以保持在体细胞的分化功能，而三维培养模式则能够弥补这些不足。近年来，随着细胞外基质的发展，使得进行体外三维重建外泌汗腺结构成为可能［13］。Shenyou等［14］使用经Ⅱ型胶原酶消化分离的人体外泌汗腺组织，进行体外三维培养，并对构建的三维组织进行了形态学分析。实验结果显示，通过倒置相差显微镜观察经Ⅱ型胶原酶消化后的大量汗腺组织游离，其在贴壁后3～5d长出汗腺细胞，细胞持续分裂达2～3周，并形成围绕汗腺组织块的环状单层，3～4周后出现细胞衰老。再将汗腺细胞接种于Mat rigel基底膜基质中，2～3周后细胞开始分裂，然后相继形成小细胞团、管状以及类球状结构；混合培养物在约2周时开始液化，培养随之终止。HE染色显示部分细胞形成中空管状结构，管壁由1～2层细胞组成，这种管状结构类似于体内汗腺的分泌部和导管部。通过免疫组织化学染色可见，所培养的汗腺细胞CK7和CK19表达均呈阳性。结果表明，经三维培养的人体外泌汗腺细胞，接种于Mat rigel基底膜基质所形成的组织结构模拟了在体汗腺的组织形态结构。

Tan Zhi jun等［15］研究了汗腺细胞的分离、培养、纯化和表型鉴定。首先将取自人体腹部皮肤的组织样本采用Ⅱ型胶原酶消化处理，实验过程中通过倒置相差显微镜观察可见培养皿中有大量游离的汗腺腺体组织，被从组织样本中分离出来。分离得到的汗腺腺体组织经一段时间的培养后，可以观察到新生的汗腺细胞从汗腺腺体中间呈辐射状，向腺体周围生长，并且呈现出不规则的多角形和扁平状的形态特征。在新生的汗腺细胞外围有少量呈长梭形的成纤维细胞，对此在实验中使用胰酶-EDTA消化处理后，结果显示可以将汗腺细胞周围95%以上的成纤维细胞去除。最后对纯化的汗腺细胞经免疫细胞化学染色，结果显示成纤维细胞特异性蛋白和细胞波形蛋白均为阴性，而汗腺细胞标志物CEA、CK8则为阳性，证明所培养的细胞为汗腺细胞，成纤维细胞则在胰酶-EDTA消化处理中被有效去除。

2　干细胞向汗腺细胞分化的研究

随着组织工程皮肤的发展，对于汗腺再生的研究越来越受广大学者的关注。如：利用胚胎干细胞和诱导多功能干细胞进行汗腺再生；李海红等［16］证实的利用骨髓间质充质干细胞进行汗腺再生，刘爱军等［17］用ESP源性表皮干细胞修复小鼠创伤皮肤的实验，Suaudcan［18］证实了iPS细胞代替ESP进行汗腺再生的可能。笔者将介绍众多原始细胞中的表皮干细胞和脐带间充质干细胞向汗腺细胞的分化。2.1表皮干细胞向汗腺细胞分化

表皮干细胞（Epidermal Stem Cel ls，ESCs）作为皮肤组织的特异性干细胞，是皮肤组织发生、创面修复及改建的关键性细胞［19］。因此，可通过诱导表皮干细胞定向分化汗腺细胞，这是汗腺再生的重要途径之一。

根据研究，首先通过降低β1整合素的表达和MAPK活性，从而使得表皮干细胞退出干细胞群落，进而参与汗腺的发生与汗腺细胞的定向分化。然后控制ECM改建酶-基质金属蛋白酶（MMPs），调节ECM、MMPs与生长因子的相互作用［20-21］，通过诱导表皮干细胞分泌LN、FN来影响其合成与分泌MMP-2与MMP-7，从而影响汗腺原基细胞的出现，在通过MMPs对ECM的作用，定向引导了汗腺原基细胞向汗腺胚芽细胞并突破基底膜区向真皮区切入，从而向成熟的汗腺细胞分化；并且宋志芳等［22］通过实验研究发现miRNA可以诱导人表皮干细胞向汗腺细胞的一个分化，可能一直通过p63来完成之一转化。

2.2间充质干细胞向汗腺细胞分化

间充质干细胞（mesenchyme stem cel ls，MSCs）以其具有组织再生和功能重建的巨大潜能激励着研究者们不断探索MSCs的应用价值。周岗等［18］研究了人骨髓间充质干细胞向汗腺细胞诱导培养中的基因表达方式，通过分离纯化并体外扩增MSCs，对参照组和不同诱导组进行观测细胞形态学变化，以及采用RT-PCR、流式细胞仪等方法检测融合细胞基因和蛋白的表达特征。实验结果显示，在不同条件培养液中人骨髓间充质干细胞的诱导培养均能存活，并且当培养达到一定时间后，其细胞形态会由间充质干细胞的长梭状开始向SGCs的扁平状转变。随着培养时间的进一步延长，与汗腺发生形成密切的基因EGF和EGFR出现高度表达。实验结果展示了在不同介质诱导培养下，人骨髓间充质干细胞可以在形态学和分子水平上，表现出向SGCs横向分化的潜能。蔡飒等［23］通过人体外分别分离培养MSCs和SGCs，再经原代培养SGCs融合。实验结果也展示出在没有完整汗腺细胞存在的情况下，人骨髓间充质干细胞在体外可以诱导分化为人汗腺细胞。

Ai Li等［24］通过体外分别分离培养、扩增，并鉴定骨髓间充质干细胞和汗腺细胞，建立汗腺细胞体外热休克模型。通过对比骨髓间充质干细胞形态学变化，以及应用免疫组织化学和流式细胞仪法检测对比，结果显示骨髓间充质干细胞能够被成功诱导向汗腺细胞转化，获得汗腺细胞表型。建立适当的体外汗腺诱导培养体系，中胚层骨髓间充质干细胞通过跨胚层分化途径能够转变为汗腺细胞。郝文杰［25］研究了人脐带间充质干细胞向汗腺细胞的转化，并分析了表皮细胞生长因子对转化的影响，以及细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）信号通路在转化过程中的作用。采用组织块法培养获得了纯化的脐带间充质干细胞，通过胶原酶消化法获得了纯化的汗腺细胞。实验显示脐带间充质干细胞与热损伤的SGCs经Transwel l板间接共同培养后，部分脐带间充质干细胞表面抗原CK7、CK19、CEA表达阳性，说明脐带间充质干细胞已经具有SGCs的表型，显示体外SGCs损伤的微环境具有促进脐带间充质干细胞向SGCs分化的作用。研究中还发现EGF能够明显促进脐带间充质干细胞向汗腺细胞转化。并且在采用共培养的方法诱导脐带间充质干细胞向SGCs转化，以及在EGF促进脐带间充质干细胞向汗腺细胞转化的过程中，ERK通路具有重要作用。

2.3毛囊干细胞向汗腺细胞分化

在王瑶［26］的研究中，分别采用“酶消化-毛囊剥离-酶消化”和“酶消化-毛囊剥离-直接种植法”两种方法，进行体外分离毛囊干细胞（Hai r Fol l icle Stem Cel ls，HFSCs），实验显示HFSCs在适宜的微环境中，可以被诱导分化为SGCs。通过建立的共培养诱导体系将HFSCs定向诱导分化得到SGCs。并且试验还显示诱导分化而来的汗腺细胞是有功能的，能够参与皮肤创面中的汗腺再生。

3　汗腺细胞的临床应用研究

近年来，随着皮肤组织工程的不断发展，汗腺再生的研究广泛应用于皮肤创伤和修复手术当中，这为提高大面积烧伤患者存活后的生活质量带来了希望。如通过干细胞移植诱导汗腺再生，并验证再生的汗腺具有发汗功能，对实现创伤的修复给出了希望。

盛志勇院士等［27］通过成体干细胞诱导出汗腺细胞，并成功将汗腺细胞分别种植于裸鼠损伤汗腺皮肤及成人瘢痕皮肤处，实验结果表明：裸鼠治疗侧脚掌足垫处可见大片汗腺腺体组织，有发达且盘曲的分泌部；免疫组化检测证实汗腺组织结构完整，包含完整的分泌部和导管部；CK14在其所在处皮肤基底层和汗腺导管部连续分布，CEA染色显示有完整发达的汗腺组织，创面汗腺结构也就可见CK8和BrdU双染色性细胞；相对裸鼠而言，人体试验结果显示2例患者的治疗区发汗试验均阳性，治疗区创面愈合部位真皮浅层有大量CEA阳性细胞，并且较为集中，形态和汗腺组织极为相似。裸鼠及成人的对照组均未有上述实验组表现。虽然人体试验的病例数相对而言较少，且种植面积的局限性，但为人们进一步寻找外分泌汗腺再生修复途径提供了新的思路及方法。

目前，对原发性手汗症（Pr imary Palmar Hyperhidrosis，PPH）发病机制的研究尚无明确结论，现有研究多认为PPH发病机制与交感神经的过度兴奋有关，因此，相关研究多关注对交感神经本身及其相关神经递质等的研究［28］。但基于汗液的主要成分分析，其成分主要经由汗腺细胞膜上相关蛋白转运而实现汗液的分泌过程，水通道蛋白在其中的作用十分重要。水通道广泛存在于动植物以及微生物细胞膜上，它是具有特异性转运水分子功能的通道，由一系列水通道蛋白组成，其中水通道蛋白5是促使水分子加快转运的跨膜蛋白，水通道蛋白5与体内液体的运转以及大多数腺体的分泌有着密切关系。杜泉［29］使用胸腔镜下胸交感神经干切断术（Endoscopic Thoracic Sympathectomy，ETS），于人体腋窝自然褶皱处取得皮肤标本，通过体外汗腺细胞培养检测多汗症患者腋窝汗腺水通道蛋白5（Aquapor in5，AQP5）的表达与定位，并通过建立人体汗腺细胞体外模型的实验研究，发现汗腺AQP5蛋白表达增强可能与神经体液机制有关。

4　展望

瘢痕作为一个全球性的难题，一直以来深受整形外科医生的重视，减少瘢痕的产生、加快瘢痕的愈合速度向来都是创面愈合研究的方向。皮肤附属器作为附属器再生或者瘢痕修复的主要细胞来源，起着举足轻重的作用。缺乏汗腺的瘢痕愈合部位因为患者无法排汗来调节体温，大大降低了其生活质量，因此汗腺细胞的研究也显得十分迫切。

近几年，利用干细胞技术诱导和移植技术来促进大面积烧创伤患者汗腺的修复和再生已取得了一定程度的进展，通过对干细胞和热休克的汗腺细胞共培养，促进干细胞的分化体系已经非常成熟，对于汗腺的再生有着很大帮助。但是汗腺作为一个人体的小器官，其分离培养以及可以使用的传代数可利用率比较低，这也是限制汗腺细胞研究发展的主要方面，本文主要是总结前人的经验，希望可以为以后汗腺细胞的发展提供一定的帮助，进而造福因烧创伤后汗腺缺失导致生活质量下降的患者。

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Research progress of human sweat gland cells in trauma and repairCHEN Fu-huan，SONG Hui-feng，WANG Tong-ming，HE Xiu-ye，YUE Xiao-tong

CHEN Fu-huan，SONG Hu i-feng，WANG Tong-m ing，HEXiu-ye，YUEXiao-tong
（Departmentof Burn and Plastic Surgery，The First Affiliated Hosp ita lo f PLA GeneralHosp ital，Chinese PLAMedica lSchool，Beijing 100048，China）

Sweat g land，as the bod y's largest organ-the skin im portant appendages，p lays an important role in the human body.A large area of severely burned or trauma patients，because of the inab ility of evaporating through sweatg land，affects the quality of life o fpatients.Developmento f tissue engineering technology for large area of skin has p rovided a new method for skin defects，and got som e certain effec t.This paper，firstly w ith the help of literature research，introduces the basic form and func tion o f Sweat g land ce lls，Second ly to exp lore the re levant origina l ce ll d ifferentiation into sweat g land cells；introduced in detail epidermal stem cells（ESCs）and hum an umbilical cord mesenchym al stem cells（MSCs）to d ifferentiate into sweatg land cells，and its differentiation pathways such as MAPK、ERK and so on.then the expounds on the status quo of sweatg land cells in vitro；Finally analyzes the regeneration of sweatg land cells for skin trauma and repair.

sweat g lands；sweat g land cells；ep iderma lstem cells；mesenchym alstem cells；skin injury；repair

R641

A

1008-6455（2015）19-0073-04

2015-08-19

2015-09-29

编辑/李阳利

国家自然科学基金（编号：81171821）

陈甫寰，在读研究生

宋慧锋，主任医师；主要研究方向：美容整形、瘢痕整形以及组织工程等方面；E-mai l：song_hui feng@126.com