阿霉素对乳腺癌干细胞的体外作用研究

于晓军

（吉林省吉林市中西医结合医院乳甲外科，吉林 吉林 132012）

阿霉素对乳腺癌干细胞的体外作用研究

于晓军

（吉林省吉林市中西医结合医院乳甲外科，吉林 吉林 132012）

目的通过实验观察研究阿霉素对于乳腺癌干细胞的病理药理的作用，从而来研究乳腺癌细胞系MCF-7干细胞通过使用了药物阿霉素在其体外所产生的变化，来选择乳腺癌干细胞更有针对性的治疗方案和研究比较更加行之有效的药物。方法使用流式细胞仪器，在乳腺癌细胞系（MCF-7），剥离乳腺癌干细胞CD24（-/low）、CD44（+）、ESA（+）。在浓度不同的阿霉素培养液中放置乳腺癌干细胞与没有进行分拣的细胞，测得阿霉素对不同干细胞的抑制生长生，进行细胞凋亡及克隆形成能力的分析。结果MTT表明乳腺癌干细胞具有耐药性。药物阿霉素呈浓度依赖型抑制了乳腺癌未分类细胞及干细胞：未分类细胞IC50为5.5 µmol/L；而分选出的干细胞IC50为29.1 µmol/L（P＜0.001）。乳腺癌干细胞在使用药物阿霉素可加速病变的恢复，随着用药时间的增加其效果愈加明显。研究中还发现，乳腺癌干细胞在阿霉素的作用下可减少其形成和扩散。结论乳腺癌干细胞在使用了药物阿霉素成瘤性有所降低，对于其克隆能力具有抑制作用，其变化呈时间依赖型与浓度依赖型。

乳腺癌；干细胞；阿霉素

相关研究发现，有极少的肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）包含于肿瘤细胞当中，这些干细胞不仅具有分化成各种不同类型肿瘤细胞的能力，而且具有长时间的自我更新能力，这些特性决定了其在恶性肿瘤的发生、发展中发挥了极其重要的作用[1-2]。

阿霉素（adriamycin，ADM）是具有细胞周期非特异性的药物，可以有效的杀死有害细胞，有很好的抑制肿瘤细胞克隆的作用，是乳腺癌化学治疗常用药物[3]。研究人员在含有了浓度不一样的阿霉素干细胞培养液中放置未分类细胞以及乳腺癌干细胞，观察阿霉素在干细胞移植动物模型中发挥的抑制作用，检测阿霉素对MCF-7干细胞生长的抑制曲线，分析乳腺癌干细胞在使用阿霉素时准确的效果。

1 材料与方法

1.1 材料：人体乳腺癌细胞系MCF-7的细胞株。

1.2 实验方法

1.2.1 乳腺癌干细胞：使用流式仪分选出ESA（+）、CD44（+）、CD24（-/low），放置于6孔板或96孔板。将干细胞置于培养液中：含20 ng/mL EGF，1∶50 B27，4 µg/mL 胰岛素DMEM，F12（1∶1）的培养液，0.400%牛血清白蛋白，阻止干细胞分化情况[4-5]。

1.2.2 MTT实验：利用MTT方法（the 3-（4-5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromidedye reduction assay），比较阿霉素对乳腺癌未分类细胞以及干细胞的作用影响。不同药物浓度的96孔板中每一浓度设5个复孔放置没有进行分类的MCF-7细胞与干细胞，在培养箱中37.0 ℃的实验温度，5.0% CO2下进行；阿霉素的作用浓度分别为0.1、1、10、50、100 μmol/L；药物作用24 h后，每孔注入MTT 20 μL（将PBS配成5 mg/mL）然后继续培养4 h之后结束，进行去除无关液体的处理之后，混合DMSO 150.0 μL，摇匀处理10 min。观察光吸收值（OD值），每组重复3次试验，把记录的结果标注。在SSPS18.0软件中输入实验数据，得出抑制浓度IC50。

1.2.3 检验细胞调亡变化，检测细胞凋亡率，检验阿霉影响素干细胞凋亡的情况。通过软克隆琼脂的实验，在40×10镜下观察其变化。记录超过30个细胞菌落的细胞数量。重复进行3次试验。

2 结 果

2.1 MCF-7干细胞比例。本实验结合了现在医学界常用的乳腺癌干细胞的表型：CD24（-/low），CD44（+），ESA（+），对乳腺癌细胞系MCF-7进行干细胞的分选。其中，MCF-7中干细胞占了（1.4±0.26）%。

2.2 MTT实验结果：阿霉素作用的浓度梯度为0.1、1、10、50、100 μmol/L，作用时间均为24 h。使用MTT的检测方法发现，阿霉素抑制了乳腺癌细胞的克隆，并且随着药物作用的浓度的增加跟随增加。MCF-7乳腺癌干细胞要比未分类的乳腺癌细胞更具有耐药性：其中未分类细胞IC50为5.5 µmol/L；而分选出的干细胞IC50为29.1 µmol/L（P＜0.001）。

2.3 阿霉素作用于干细胞对其凋亡的影响：进行分析干细胞早期的凋亡。结合对照组（3.180±1.060）%早期凋亡率对比，阿霉素在实验24、48、72 h之后MCF-7干细胞凋亡率为（8.30±0.45）%、（10.29± 0.87）%及（14.79±1.53）%，具有统计学的意义（P＜0.01），且凋亡率与药物作用时间成正比，呈时间依赖性。72 h后阿霉素在作用于乳腺癌的原代干细胞时可达到最大值，并诱导干细胞早期的凋亡，具有统计学意义。

2.4 乳腺癌干细胞结合阿霉素时体外克隆能力的影响：在本实验中，MCF-7干细胞在分别在含或不含10 μmol/L阿霉素药物的培养液中培养了两周时间，40×10镜下观察克隆进行的变化。镜下选取随机4点进行克隆的计数取其平均值。在实验中结合对照组的克隆率为100%，阿霉素组中的克隆率为（60.50±7.54）%（P＜0.001），两组间的克隆形成有显著区别。

3 讨 论

当今以研究乳腺癌干细胞的试验研究不多，在研究中发现阿霉素在乳腺癌干细胞中发挥的作用。实验表明阿霉素可有效抑制肿瘤干细胞发展。这将为阿霉素进一步应用在临床治疗上提供了依据。

通过对体外克隆形成能力及细胞凋亡的实验表明：在结合未分类细胞时效果相似，可以降低体外克隆的干细胞，而且乳腺癌干细胞在使用阿霉素之后可以早期凋亡。研究表明阿霉素对乳腺癌干细胞的效果和克隆形成及早期凋亡密切相关。郑建勇等[6]诱导肝癌细胞HCC-9204凋亡时使用阿霉素，结果发现了BCL-2细胞大量凋亡，蛋白大量减少。王文武[7]等建立了MCF-7细胞建立了小鼠模型，研究结果表明：阿霉素有加速小鼠MCF-7乳腺癌的细胞凋亡和抑制其克隆的作用。综上所述表明，抑制增殖乳腺癌干细胞、诱导细胞凋亡可以通过使用阿霉素来实现。

综上所述，阿霉素具有一定耐药性，但在一定程度上它可以抑制乳腺癌干细胞生长。在抑制乳腺癌干细胞生长机制方面可能与可以加快乳腺癌干细胞的早期凋亡、降低体外复制形成能力相关，它的抗肿瘤作用机制，还要继续实验挖掘与完善。

[1]Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A,et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7): 3983-3988.

[2]Bell DR,Van Zant G.Stem cells,aging,and cancer: inevitabilities and outcomes[J].Oncogene,2004,23(43): 7290-7296.

[3]Li QQ,Xu JD,Wang WJ,et al.Twist1-mediated adriamycin-induced epithelial-mesenchymal transition relates to multidrug resistance and invasive potential in breast cancer cells[J].Clin Cancer Res, 2009,15(8):2657-2665.

[4]Dontu G,Abdallah WM,Foley JM,et al.In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells[J].Genes Dev,2003,17(10): 1253-1270.

[5]Serrano D,Bleau AM,Fernandez-Garcia I,et al.Inhibition of telomerase activity preferentially targets aldehyde dehydrogenasepositive cancer stem-like cells in lung cancer[J].Mol Cancer,2011, 10(1):96.

[6]郑建明,李开宗,王为忠,等.阿霉素诱导人肝癌细胞凋亡机制的研究[J].中国普通外科杂志,2005,14(7):509-511.

[7]王文武,欧阳学农,姜浩.阿霉素诱导小鼠MCF-7乳腺癌细胞凋亡和抑制增殖的体内实验研究[J].中国临床药理学与治疗学, 2005,10(6):78-80.

R737.9

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1671-8194（2015）02-0057-02