丹参水溶性化合物抗心肌缺血作用的研究进展

陈俞材，方莲花，杜冠华

(中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京市药物靶点研究与新药筛选重点实验室，北京　100050)

丹参水溶性化合物抗心肌缺血作用的研究进展

陈俞材，方莲花，杜冠华

(中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京市药物靶点研究与新药筛选重点实验室，北京100050)

中国图书分类号：R-05；R282.71；R284.1；R322.11；R542.2

摘要：丹参为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，其水溶性化合物被公认为是丹参抗心血管疾病的活性成分。该文查阅近年来国内外研究文献，从预防、治疗及防治再灌注损伤等多层次药理作用对丹参水溶性化合物抗心肌缺血作用进行综述，为丹参中活性单体成分及其复方制剂的研发提供理论依据。

关键词：丹参；水溶性化合物；心肌缺血；丹酚酸；丹参素；抗氧化

丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge的干燥根及根茎，用于祛瘀止痛、活血通经、清心除烦。丹参提取物中的有效成分可分为脂溶性和水溶性成分两类：前者多属于二萜醌类化合物，包括丹参酮(tanshinone)、丹参酮ⅡA(tanshi noneⅡA)、隐丹参酮(cryptotanshinone)等；后者多具有抗心肌缺血活性，主要为酚酸类化合物，有丹参素、丹酚酸A(salvianolic acid A)、丹酚酸B(salvianolic acid B)、原儿茶醛(protocatechualdehyde)等[1]。

丹参在传统中医应用中多使用水煎剂，加之历代医家常有“一味丹参，功同四物”之说，表明其活血功效显著。故综合研究丹参中水溶性化合物对心肌缺血的保护作用具有重要意义。丹酚酸A最早是由黎莲娘教授于丹参中分离得到，基于其明显的药理活性，多年来一直是科研工作者的研究热点[2]。本文将着重关注丹酚酸A与丹参中其他水溶性成分在抗氧化、抗心肌缺血/再灌注方面的活性比较，为丹参水溶性单体成分及其复方制剂的研发提供理论依据。

心肌是高度依赖于有氧氧化供应能量的组织。心肌缺血是指心肌的供血量减少或心肌对氧的需求量增加超过其最大供血量，从而引起心肌代谢、功能和结构改变。虽然甲状腺功能亢进等可引起组织需氧量增加，造成心肌相对缺血，但临床上引起心肌缺血的最主要原因是冠状动脉供血量减少。根据病理状态不同，心肌缺血又可分为完全缺血和部分缺血：前者若得不到及时救治，在短时间内便会引起大面积心肌坏死；后者往往继发于冠状动脉粥样硬化、血管痉挛等引起的冠脉狭窄以及心肌损伤。

1丹参水溶性化合物从多角度发挥保护缺血心肌的作用

1.1降低心肌缺血诱因传统观念认为，血流量减少引起的慢性心肌缺血是由冠状动脉粥样硬化斑块缩小血管内径，限制了心肌的血液供应。而近期研究表明，冠脉血流减少继发于固定性血管狭窄与血管张力异常的共同作用，而血管张力的异常则由粥样硬化引起的内皮细胞功能紊乱所致。同时，血管内皮损伤又是形成动脉粥样硬化的始动环节，因为只有在内皮损伤引起通透性增高后，血液中的脂质成分才得以进入内皮间隙，继而产生氧化应激等一系列反应。大量实验结果表明，丹参水溶性化合物不仅可以从各个环节减缓动脉粥样硬化病程，也可改善粥样硬化引起的周围血管内皮细胞功能紊乱。

丹酚酸A可降低高血脂症大鼠总胆固醇、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)水平，从根源上降低冠状动脉粥样硬化的发生风险[3]。平滑肌细胞增殖、迁移是动脉粥样硬化病程中的关键环节，丹参水提物可明显抑制这一过程[4]。丹酚酸B可抑制单核细胞黏附于血管损伤部位，阻止其进一步分化成巨噬细胞[5]。此外，丹酚酸B也可抑制LDL转变成氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)[6]。丹参水提物可剂量依赖性地抑制泡沫细胞生成，减少其凋亡后脂质堆积形成的脂肪斑[7]。丹酚酸A可通过抑制磷酸肌醇-3激酶(phosphoinositide-3 kinase，PI3K),从而抑制血小板激活和动脉血栓形成[8]。

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是甲硫氨酸(methionine，Met)代谢的副产物，体内Hcy浓度升高将导致高半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia)，继而诱发粥样硬化、血栓栓塞、中风及血管性痴呆。在体外水平，5 mmol·L-1浓度的Hcy不仅可以抑制人脐静脉内皮细胞的生存能力，还能破坏内皮细胞管状物的形成。Hcy可能通过自氧化作用来激活氧化应激，产生的活性氧又可与一氧化氮形成亚硝酸过氧酯(lipid peroxy-nitrites)，从而降低一氧化氮的利用率。此外，Hcy还可以抑制细胞内谷胱甘肽过氧化物酶的表达，间接增强氧化应激造成的损伤。丹参素能剂量依赖性地改善Hcy引起的内皮细胞生存能力损伤。

管腔形成试验是体外模拟血管新生的经典模型。Hcy可抑制细胞增殖、迁移以及胞外基底膜降解等血管新生的多个环节，内皮细胞在血管新生过程中起着关键作用。在冠状动脉粥样硬化病程中，内皮细胞的过度增殖也起重要作用，引起血小板聚集和白细胞的黏附和迁移，丹酚酸A能在体外剂量依赖性地抑制血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)引起的内皮细胞过度增殖，此作用与其时间以及剂量依赖性地抑制Ang Ⅱ引起的胞内Src、Akt磷酸化相关[9]。功能蛋白质组学的实验也证明，丹参水提物可明显减轻粥样硬化损伤[10]。以上研究表明，丹参水溶性化合物从多途径降低心肌缺血诱因。

1.2增加冠状动脉供血丹酚酸B在高钾、高钙和组胺刺激的离体冠状动脉环收缩模型中均表现出舒张作用，这一作用通过阻断钙通道来实现[11]。丹酚酸B可通过多条通路增加冠状动脉NO生成，扩张冠状动脉[12]。ATP依赖的钾通道(KATP)是心肌缺血预适应信号转导途径中的重要中介物，丹参水提物可通过开放电压依赖性钾通道、KATP和内向整流钾通道来舒张血管[13]。

1.3减轻缺血损伤

1.3.1清除自由基在心肌组织，生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)的促氧化系统涉及多种酶类，如单胺氧化酶、黄嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)等，而清除ROS的抗氧化防御系统则主要由过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽系统等组成。

生理条件下，心肌组织的促氧化系统和抗氧化系统处于动态平衡，ROS生成很少，维持基础水平。病理状态下，如心肌缺血、低氧时，ROS清除系统功能降低(过氧化氢酶、SOD等活性降低)，ROS生成系统活性增强(黄嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶等活性增加)，造成ROS堆积。一方面，ROS可以直接与细胞内脂类、蛋白质和DNA发生反应；另一方面，ROS可以激活氧化还原信号途径，引起心肌功能与形态损伤。

由于丹酚酸A、丹酚酸B的多酚酸化学结构，其本身就具有较强的抗氧化能力。在DPPH及ABTS自由基清除能力检测等体外试验中，二者均表现出极强的自由基清除能力[14]。丹酚酸A也可减轻过氧化氢对细胞造成的氧化应激损伤[23]。在体内，丹酚酸A可降低缺血心肌的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)外漏[15]。丹酚酸A亦可通过抑制Ang Ⅱ引起的内皮细胞中NADPH氧化酶亚型Nox4的表达，来减少ROS的生成。

线粒体呼吸紊乱是氧化应激引起细胞死亡的一个突出特征。异丙肾上腺素通过作用于NADH氧化酶来影响线粒体呼吸过程，在异丙肾上腺素致心肌缺血模型中，静脉注射较低剂量丹酚酸A就能明显改善线粒体呼吸功能[16]。在阿霉素诱导的心脏毒性实验中，丹酚酸B可抑制其氧化应激的发生[17]。也有研究表明，丹酚酸A在自由基清除、抗脂质过氧化及抗羟自由基诱导的脱氧核苷酸降解方面的作用明显强于丹酚酸B[18]。

1.3.2抗血小板聚集和血栓生成丹参的抗血小板聚集作用早在1982年就已有报道。在体外实验中，丹酚酸A能明显抑制花生四烯酸、凝血酶和ADP诱导的血小板凝集，其效价强度依次为ADP>凝血酶>花生四烯酸。丹酚酸A在多种模型中均表现出抗血小板聚集作用，表明其可能作用于血小板激活过程中的某种共同信号通路分子。在内源性凝血途径中，丹酚酸A可抑制纤维蛋白原与单个血小板的结合，在外源性凝血途径中，则可抑制血小板在纤维蛋白上的延伸，血小板在这两条凝血途径中的作用又都受PI3K通路的调节。有进一步实验表明，丹酚酸A可抑制PI3K信号通路下游分子Akt的磷酸化。

冠状动脉血流量不能根据机体需要接受调节是心肌缺血的根本原因之一。临床研究表明，冠心病患者心肌缺血发作时，血小板聚集和血栓形成增强，提示心肌缺血患者体内存在相应的血小板活化。抗血小板药物也是临床上心肌缺血治疗的一个重要内容。血小板的最初激活是由于血管损伤部位的剪切应力与血管性假性血友病因子的相互作用及受损内皮下胶原暴露所引起。也有研究表明，丹酚酸B通过促进血管内皮细胞分泌前列环素I2发挥抗血小板聚集的效应，而且正常的流动剪应力是丹酚酸B发挥抗血小板聚集效应的有利条件之一。

1.3.3改善缺血心肌能量代谢心肌不能大量储存脂肪和糖原等能量底物，其储存的磷酸肌酸等高能磷酸化合物亦很有限。因此，心肌对能量代谢的变化非常敏感。心肌以脂肪酸为底物进行氧化反应可产生大量乙酰辅酶A，使AcCoa/Coa比值升高，而以葡萄糖为底物氧化产生的乙酰辅酶A可在乙酰辅酶A羧化酶作用下生成丙二单酰辅酶A，后者可抑制脂肪酸氧化。在对大鼠离体心肌能量代谢的研究中发现，丹参中酚酸类物质能够明显降低AcCoa/Coa比值，抑制脂肪酸氧化，促进线粒体内氧化磷酸化过程，提高心肌代谢效率[19]。通过以上结果可见，丹参水溶性化合物从多角度减轻心肌缺血损伤。

2丹参水溶性化合物抗心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤的作用

临床上对心肌缺血的应对措施是及早恢复血液灌注，常用的方法包括溶栓治疗、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)以及冠状动脉旁路移植(coronary bypass grafting)等。然而再灌注过程也是一把双刃剑，研究表明，再灌注会引起心脏功能性损伤、心律失常、加速心肌细胞坏死等过程[20]。所以，抗心肌I/R损伤药物作为临床心肌缺血辅助治疗越来越受到研究者们的关注。

氧自由基系统在I/R损伤中起重要作用。缺血区的心肌细胞和内皮细胞在再灌注时释放出大量氧自由基，继而激活中性粒细胞、加剧膜损伤和钙超载。I/R过程中常伴有血液中谷胱甘肽(glutathione，GSH)、SOD以及过氧化氢酶(catalase，CAT)等抗氧化物质水平降低。丹参水提物可明显降低体内丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde，MDA)含量，提高GSH、SOD等抗氧化物质水平[21]。研究表明，JAK2-STAT3通路在I/R病程中扮演重要角色[22]，丹参水提物可剂量依赖性地抑制缺血心肌中JAK2以及STAT3蛋白水平，从而降低心肌细胞凋亡率，达到保护受损心肌的作用[23]。

心肌I/R过程常伴随心肌细胞凋亡和坏死，PI3K-Akt通路在这一过程中常发挥重要作用，抑制PI3K会加速凋亡过程，而激活Akt则阻断凋亡。研究发现[24]，丹酚酸B预孵育的心肌细胞中可见Akt磷酸化水平明显增强，Bcl-2蛋白含量增加，Bax蛋白含量降低，而丹酚酸B的保护作用可被PI3K抑制剂LY-294002所逆转。在心肌H9c2缺氧/复氧模型中，丹参素给药组在1 μmol·L-1剂量下即可明显抑制细胞LDH的释放。流式细胞术以及TUNEL结果显示，与模型组相比，丹参素给药组可明显降低缺氧/复氧造成的心肌细胞凋亡，此作用可被PI3K特异性抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)以及ERK特异性抑制剂U0126所逆转，提示丹参素的抗I/R作用与PI3K-Akt通路有关。整体动物研究结果也显示，丹参素可剂量依赖性地降低I/R造成的心肌坏死面积，减少血清中肌酸激酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTnI)和LDH的水平。

在离体大鼠心脏I/R损伤模型中也发现，丹参素的体内代谢产物丹参素异丙酯能够剂量依赖性地减轻心肌细胞线粒体结构损伤，改善心肌能量代谢[25]。有研究对丹酚酸A和丹酚酸B抗心肌I/R损伤效果进行比较发现，丹酚酸B的ED50约为丹酚酸A的6.3倍，表明丹酚酸A在防治心肌I/R损伤方面具有更好的疗效[26]。以上结果表明，丹参水溶性化合物在细胞、离体组织以及整体动物模型上均显示良好的抗I/R损伤的作用。

3结语与展望

综上所述，丹参水溶性化合物可从心肌缺血的不同阶段发挥保护作用，降低损伤。这一类化合物不仅可在急性心肌缺血中及时显示疗效，还可在慢性病理过程中延缓疾病的发生和发展，同时又在心肌恢复血液供应后防止再灌注损伤。其活性单体成分的药效与自古以来丹参水煎剂的临床应用一脉相承。作为作用于循环系统的药物，研究人员更关注其明确的靶点以及更低的毒副作用。现代药理学研究不但关注其单体成分的研发以降低副作用，也致力于明确抑或开发新的适应症，丹参水提物复方制剂也逐渐成为研究热点之一。

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网络出版时间：2015-1-9 13:37网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.004.html

Research advances in protective effects of water soluble compounds

inSalviamiltiorrhizaagainst myocardial ischemia

CHEN Yu-cai, FANG Lian-hua, DU Guan-hua

(BeijingKeyLaboratoryofDrugTargetsIdentificationandDrugScreening,InstituteofMateriaMedica，

ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Abstract:Salvia miltiorrhiza is dry root or rhizome of the labiatae plant Salvia miltiorrhiza, whose water-soluble ingredients are recognized as its bioactive components in cardiovascular diseases. Based on researches at home and abroad in recent years, this article summarizes pharmacological effect resisting myocardial ischemia of Salvia miltiorrhiza’s water soluble compounds in multi-level from the prevention, treatment and anti-reperfusion damage, to provide theoretical basis for the research and development of the active monomers in Salvia miltiorrhiza and compound preparations.

Key words:Salvia miltiorrhiza; water soluble compounds; myocardial ischemia; salvianolic acid; tanshinol; antioxidant

通讯作者方莲花(1963-)，女，博士，研究员，博士生导师，研究方向：心脑血管药理学与新药发现，，Tel：010-63165313，E-mail: fanglh@imm.ac.cn; 杜冠华(1956-)，男，博士，研究员，博士生导师，研究方向：神经药理学与新药发现，，Tel: 010-63165184，E-mail: dugh@imm.ac.cn

作者简介：陈俞材(1990-)，男，硕士生，研究方向：心脑血管药理学与新药发现，Tel: 010-63131571，E-mail: maxcyc@imm.ac.cn;

基金项目：国家科技部“重大新药创制”科技重大专项(No 2013ZX09103001-008，2012ZX09103101-078)

收稿日期:2014-10-11,修回日期:2014-11-03

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2015)02-0162-04

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.004