应用MLPA技术分析非平衡性染色体结构异常＊

谢润桂，娄季武，刘彦慧，林洋洋

（东莞市妇幼保健院产前诊断中心，广东东莞523107）

多重连接依赖探针扩增（MLPA）是一种结合分子杂交、连接和聚合酶链反应（PCR）的半定量检测技术，于同一反应管内可同时检出40个不同核苷酸序列拷贝数的变化［1］。和临床常规应用的染色体核型分析技术相比，MLPA具有快速、特异、灵敏、高效的特点。MLPA在染色体病诊断方面主要用于快速检测胎儿染色体非整倍体数目异常［2－4］，而在非平衡性染色体结构异常诊断中的应用比较少。本研究联合利用染色体非整倍体检测试剂盒及染色体亚端粒检测试剂盒分析6例非平衡性染色体结构异常，旨在探讨MLPA在非平衡性染色体结构异常诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 6例研究对象均为于本院接受产前诊断的孕妇，孕妇及其家属均知情同意。病例1，孕18周，胎儿生长发育受限，母亲血清学筛查示唐氏综合征（简称唐氏）高风险；羊水核型检查示：45，XX，der（13；18）（q10；q10）；父母核型均正常。病例2，孕27周，母亲血清学筛查示唐氏高风险，B超提示胎儿单脐动脉；脐血核型检查示：45，XX，del（18）（q22）；父母核型均正常。病例3，孕18周，母亲血清学筛查示唐氏高风险；羊水核型检查示：46，X，i（Xq）（q10）；父母核型均正常。病例4，孕18周，母亲血清学筛查示唐氏高风险，B超提示胎儿单脐动脉；羊水核型检查示：45，XY，dic（15；18）（p11.2；p11.2），18号染色体短臂末端疑似存在缺失；父母核型均正常。病例5，孕26周，B超提示胎儿双侧脑室扩张，长骨短；羊水核型检查示：47，XY，＋Mar，Mar似9号染色体短臂；父母核型均正常。病例6，孕26周，B超提示胎儿多发畸形，胎头呈草莓状，小脑下蚓部及左眼球发育不良，室间隔缺损，胃十二指肠梗阻性病变，右足趾发育不良，左趾姿态异常；脐血核型检查示：45，XY，－13，＋Mar；父母核型均正常。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 采集羊水或脐血及夫妇外周血标本，采用酚氯仿法提取基因组DNA，测定DNA浓度及纯度。

1.2.2 MLPA检测 采用荷兰MRC－Holland公司P095染色体非整倍体检测试剂盒及P036、P070亚端粒区检测试剂盒。DNA变性，探针杂交、连接及扩增均参照试剂盒说明书。采用美国ABI公司3500XL遗传分析仪对扩增产物进行毛细管电泳分析，生成的数据采用GeneMapper软件（美国ABI公司）及Coffaylser9.4软件（荷兰MRC－Holland公司）进行分析。

2 结 果

6例病例胎儿MLPA检测结果均存在异常，并且均涉及亚端粒区异常，见表1。各病例父母MLPA检测均未见异常。病例1、2、3胎儿 MLPA检测发现18p11.3、18p11.2、18q23探针信号减弱，与核型分析所发现的18号染色体存在或可疑存在部分缺失相符合。病例4胎儿X染色体长臂等臂［核型46，X，i（Xq）］MLPA检测表现为X染色体短臂探针信号减弱，长臂信号增强。MLPA分析结果提示病例5、6胎儿的标记染色体分别来自于9号和13号染色体短臂片段。

表1 染色体异常标本核型及MLPA检测结果

3 讨 论

本研究联合采用染色体非整倍体检测试剂盒及染色体亚端粒检测试剂盒分析了6例非平衡性染色体结构异常，均发现相应探针信号异常。病例1、2、3胎儿核型分析已经明确了缺失或重复的染色体片段来源，MLPA P095、P036／070试剂盒均检出相应探针信号减弱或增强，可以验证核型分析的结果。病例1、病例2胎儿核型分析均显示18号染色体短臂18p11.3存在部分缺失，MLPA检测结果也提示18p11.3探针信号减弱。病例3胎儿核型为46，X，i（Xq）（q10），MLPA检测结果也表现出很典型的特点：X染色体短臂探针信号全部减弱，长臂探针信号全部增强；提示X染色体短臂存在部分单体，而长臂存在部分三体。

MPLA检测也可帮助确定核型分析中可疑的染色体缺失或重复。如病例4所示，孕妇羊水染色体核型为45，XY，dic（15；18）（p11.2；p11.2），双着丝粒染色体中18号染色体疑似存在短臂小片段缺失。MLPA检测结果显示18号染色体短臂（18p11.21）上1个探针信号减弱，提示18号染色体短臂末端18p11.21存在缺失。同样，对于核型分析中出现的Mar片段，经MLPA检测后也反映出染色体拷贝数变化的信息。这些信息对确定Mar片段的染色体来源具有指导意义。如病例5、6所示，病例5胎儿染色体核型为47，XY，＋Mar，Mar疑似为9号染色体短臂，MLPA P036／070检测显示9号染色体短臂亚端粒区探针信号增强，而父母9号染色体短臂亚端粒区信号正常，因此可以证实该Mar片段来源于9号染色体短臂。病例6胎儿染色体核型为45，XY，－13，＋Mar，B超提示胎儿多发畸形，畸形表现符合帕陶氏综合征的表现，但核型不能确认Mar片段是否来自13号染色体。MLPA检测提示13号染色体13q21.3－q34存在缺失，与核型分析结果一致，而13q12.3－q14.3探针信号增强，说明 Mar片段来源于13号染色体13q12.3－q14.3片段。

本研究中的6例非平衡性染色体结构异常病例均经亚端粒MLPA检出染色体末端缺失或重复。涉及染色体末端的非平衡性染色体结构异常很常见［5－7］。亚端粒 MLPA含有针对23对染色体长臂和短臂末端的探针，能够准确检测染色体末端的微小缺失或重复［5］。MLPA P095染色体非整倍体检测试剂盒含有21、18、13、X染色体8对探针，Y染色体4对探针，通常用于检测21、18、13、X、Y染色体的非整倍体数目异常。本研究中5例涉及常见发生异常的13、18、X染色体，MLPA P095试剂盒也检出相应位置探针信号的增强或重复，说明采用MLPA检测染色体非整倍体改变时，如果发现个别探针，特别是染色体尾端的探针信号异常，需要加以注意。其他研究也报道了由于染色体结构异常而导致MLPA个别探针信号变化的情况［8］。

另一种常用于染色体平衡易位与非平衡易位检测的技术是荧光原位杂交（FISH）［9］。与 MLPA相比，FISH检测信号直观、准确，并且能够发现异常染色体在整套染色体中的定位。但FISH需要针对不同的平衡或非平衡易位设计（或购买）不同的探针，增加了实验的复杂性。此外，受限于荧光标记种类，FISH很难一次检测全部染色体。而MLPA一次实验可同时检测多个标本，并且亚端粒MLPA可以对每个标本的23对染色体长、短臂末端进行扫描，不需要针对不同染色体的不平衡易位设计不同探针，大大提高了检测的方便性和经济性。但是，由于受探针密度的限制，MLPA很难确定染色体缺失或重复的范围，且MLPA分析的是探针信号的强弱，只能判断有无缺失或重复，而不能发现异常染色体在整套染色体中的定位。因此，两者具有相互性［10］。

综上所述，MLPA技术，特别是亚端粒MLPA技术在非平衡性染色体结构异常诊断中具有重要价值，可以做为细胞遗传学诊断的辅助方法。

［1］ Schouten JP，Mcelgunn CJ，Waaijer R，et al.Relative quantification of 40nucleic acid sequences by multiplex ligation－dependent probe amplification［J］.Nucleic Acids Res，2002，30（12）：57－62.

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［4］ 江雨，王文博，吴琦嫦，等.MLPA技术在快速检测胎儿染色体非整倍体异常中的应用［J］.中国妇幼保健，2009，18（19）：2720－2724.

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［9］ Gignac J，Danis K，Tihy F，et al.Prenatal detection of subtelomeric rearrangements by multi－subtelomere FISH in a cohort of fetuses with major malformations［J］.Am J Med Genet A，2006，140（24）：2768－2775.

［10］ Bruno DL，Burgess T，Ren H，et al.High－throughput analysis of chromosome abnormality in spontaneous miscarriage using an MLPA subtelomere assay with an ancillary FISH test for polyploidy［J］.Am J Med Genet A，2006，140（24）：2786－2793.