原位杂交检测EBER中常见问题与对策

张丽娥353000福建省南平市第二医院

原位杂交检测EBER中常见问题与对策

张丽娥
353000福建省南平市第二医院

目的：EB病毒与许多肿瘤性疾病和非肿瘤性疾病相关，在临床检测中经常应用的检测方法有原位杂交检测法、免疫组化检测法、电镜检测法。近年来，随着科技的发展，在EB病毒检测中，EBER原位杂交检测方法已经成为最主要的检测方法，该方法具有很强的特异性和灵敏度，同时在使用的过程中也容易受到各种因素的影响。本文结合原位杂交检测的应用流程和失败原因，对其常见问题进行分析，并探讨解决策略，以期为原位杂交检测方法的有效运用提供一定的借鉴。

EBER原位杂交检测；EBV病毒；问题；对策

EBER原位杂交技术在检测Epstein-Barr病毒(EBV)时具有定位作用，能够确定病毒与组织和细胞的关系，因此，在确定EBV与疾病关系时，EBER原位杂交已成为公认的标准方法[1]。初学者往往不容易成功，现对易出现失败的原因进行分析并介绍我们的一些体会。

EBER原位杂交检测步骤

标本与试剂：从临床手术中切除的淋巴瘤组织中选取其中的一部分作为标本。试剂盒选用EBER原位杂交试剂盒，其中包含EBER探针(地高辛标记)、抗地高辛抗体(HRP标记)、胃酶、DAB浓缩液等试剂。

标本固定：标本固定的目的是为了保持标本组织形态结构的完整性，在最大程度上保证细胞内核酸水平的稳定性。标本固定使用的材料一般使用缓冲马尔福林，其溶液浓度10％，其最佳固定时间8～12 h。

切片制备：使用酒精对切片机进行清洗，在清洗后的切片机上对组织进行切片处理，切片的厚度3～4μm，将经过切片处理之后的薄片黏附在经过APES处理的载玻片上，之后将切片放在60～70℃的温度下进行烘烤，烘烤的时间＞60min。

组织常规脱蜡及水化：对切片组织进行常规脱蜡和水化处理的目的是将内源性过氧化物酶消除，将背景染色降低最小。其方法为使用浓度3％的甲醇H2O2在室温下处理5min。

消化：对切片组织进行消化处理的目的是提升组织的通透性，增强探针的穿透力，提升检测方法的敏感性。使用的试剂为蛋白酶K，因为蛋白酶K相较于其他蛋白水解酶来说，在孵育时能够实现所有核酸酶的消化[2]。消化处理的流程是：将蛋白酶K与TBS按照1：25的比例进行配置，消化处理5min，之后使用蒸馏水洗涤2min，使用100％无水乙醇Ⅰ和Ⅱ分别进行2min的脱水处理，之后放置在空气中进行自然干燥。

杂交处理：在每张切片上滴加适量的探针杂交液，使用耐热膜或者硅化盖玻片对切片进行覆盖，将湿盒中的温度控制在55℃左右，在其中进行1 h孵育；如湿盒中的温度为37℃，孵化时间＞3 h。孵化之后使用TBS溶液进行冲洗，2min/次，共冲洗3次。之后在切片上滴加EBER一抗、A液和B液，孵育时间分别为60min、10min和10min，孵育完成后均使用TBS溶液进行冲洗，2min/次，共冲洗3次。在冲洗之后，进行DAB显色和常规苏木素复染，最后进行封片处理。

失败原因分析

失败的原因主要有以下几点：①消化环节：消化不足，使得核酸暴露不充分；消化过度，使得核酸周围的蛋白结构遭到破坏，在后续步骤中导致核酸丢失，使得观察目标不清晰。②探针施加环节：在组织切片上加探针之前，组织切片未干透，探针施加失效。③杂交环节：在杂交环节，杂交液失效，或者杂交液的滴加量，杂交时间、杂交温度控制失当；在试验过程中使用的缓冲液pH过低或者过高；一抗溶液或者二抗溶液被稀释得过于严重，浓度过小；DAB失效。

EBER原位杂交检测问题

虽然EBER原位杂交检测的使用方法较为简单，但对其结果产生影响的因素也较多，其中主要表现在以下几个方面：标本取样不规范，所取得的肿瘤成分过少；组织固定不及时，固定液使用不规范，使得核酸组织受到破坏；在切片环节中，由于石蜡保留的年份过长或者操作失误，影响切片质量，影响杂交效果；在脱蜡环节脱蜡不彻底，消化失误(不足或者过度)，探针质量不佳，影响切片质量；杂交、孵育的温度和时间控制失误，使得结果呈现出假阴性；探针质量不佳使得杂交显色定位不清，影响判断；DAB沉渣附着不佳[3]，导致结果判读失误。

EBER原位杂交检测对策

完善标准取样：在进行标本取样时，要控制样本大小和肿瘤成分的多少，保证切片的完整性。

完善组织固定：在对组织进行固定时，要使用规范的固定液，保证核酸的完整性。

组织消化：在对组织进行消化时，若需要消化的组织量较大，要进行分批消化[4]，严格控制消化时间。在消化的过程中，同一批组织滴加蛋白酶K的时间要＜30 s。

滴加探针：在滴加探针时，要注意探针的量，以组织大小为依据，一般情况下，每张切片滴加探针的量5～10μL[5]。在更换探针时，要对其进行质量控制，检测新探针是否有效。

缓冲液配置：对于新配制的缓冲液，要进行充分溶解混匀，在每次使用之前都要对其pH进行测试，确定该溶液为中性缓冲液之后才能使用。

组织切片干燥处理：在进行EBER原位杂交检测之前要对组织切片进行干燥处理，保证切片的干燥性，以免组织上的水分对探针产生稀释作用，使得信号减弱或者使得信号不能有效地被表达出来。

抗体滴加：在对组织切片滴加抗体时，要把组织周边的水分拭干，以免对抗体产生稀释，在此过程中要保证组织不能干片。

样本对照：为了保证每个检测样本均能被有效地判读，要保证每一批EBER实验样本均有阳性样本作为对照[6]。

小结

对于初学者而言，在检测失败的情况下，要善于分析，逐项排除可能导致失败的原因。本实验室EBER原位杂交曾因更换了探针和中性缓冲液，连续出现失败，在确定操作步骤无误的情况下，取阳性对照片两张，以阳性探针、新探针做质控，同时测试了新配制的缓冲液的pH，发现新配制的缓冲液未充分混匀，液体上段为强碱，下段为酸性，充分混匀后pH 7.0～7.5，再次进行EBER原位杂交实验，结果：两张阳性对照片均呈阳性。总之，EBER原位杂交技术的关键重在细节，要排除任何可能导致杂交失败的原因，以保证实验的准确性和成功性。

[1] 周小鸽,张小平,张劲松.EB病毒及其相关疾病[J].诊断病理学杂志,2001,8(1)：58-59.

[2] 周小鸽,刘勇.组织学技术的理论与实践[M].北京：北京大学医学出版社,2010.

[3]林蓁.原位杂交检测HPV与EBER中常见问题与对策[J].临床与实验病理学杂志, 2014,30(8)：928-930.

[4]李琳,田玉旺,朱红艳.应用EBER原位杂交检测EB病毒的体会[J].诊断病理学杂志, 2011,18(4)：311-312.

[5] 崔锦珠.鼻咽癌患者EBER原位杂交检测EB病毒的体会[J].中外女性健康,2014,11 (6)：98.

[6] 王俊生,孔红.原位杂交检测EB病毒的体会[J].农垦医学,2014,36(2)：145-146.

Comm on problem s and counterm easures in EBER in situ hybridization detection

Zhang Lie
The Second HospitalofNanping City,Fujian Province 353000

EB virus is associated with many tumor and non neoplastic diseases,in clinical detection,themost commonly used detectionmethods are in situ hybridization detection,immunohistochemistry detection method,electronmicroscopic examination method.In recent years,with the development of science and technology,in the detection of EB virus,EBER in situ hybridization detection method has become themost important detection method,thismethod has a strong specificity and sensitivity,and it is also easy to be influenced by various factors in the process ofusing.This paper analyzes the common problems combined with the application process and the failure reason of in situ hybridization detection,explores solutions,in order to provide a reference for theeffectiveuseof in situ hybridization detectionmethod.

EBER in situ hybridization detection；EBV virus；Problem；Countermeasure

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.36.71