青蒿素对大鼠心梗后交感神经重构的影响及其机制研究

郑武扬，李卫华，谢强，黄峥嵘，万晓群

（厦门大学附属第一医院心血管内科，厦门361000）

青蒿素对大鼠心梗后交感神经重构的影响及其机制研究

郑武扬，李卫华，谢强，黄峥嵘，万晓群

（厦门大学附属第一医院心血管内科，厦门361000）

恶性室性心律失常（室性心动过速，室速；心室颤动，室颤）是心梗后患者死亡的主要原因，约占心梗后患者死亡的一半以上[1]。心梗后交感神经的过度再生，在心梗后的室性心律失常的发生中起着重要的作用，为心梗后恶性心律失常的发生提供了电学基质[2]。因此，有效地抑制心梗后交感神经过度再生，可能是预防和治疗心梗后心律失常的有效途径之一。

目前，有关心梗后交感神经重构的机制还不是很清楚。但是，有证据表明，炎症反应在心梗后交感神经重构的过程中起着重要作用[3-4]。研究显示炎症细胞合成神经生长因子（nerve growth factor，NGF），而且炎症细胞聚集的区域，交感神经再生明显，其密度显著高于其它区域[5-6]。此外，有学者相继报道，心梗后给予抗炎治疗可以显著减缓交感神经重构[7]。这些研究结果均表明，抑制炎症反应可能是减缓心梗后交感神经重构的有效途径之一。

青蒿素是一种从菊科植物黄花蒿中提取的具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物，是世界卫生组织公认的抗疟疾药物[8]。现代医学研究发现，青蒿素除了抗疟疾之外，还存在其它生物学作用，如免疫调节、抗炎症、抗纤维化等[9]。鉴于青蒿素具有抑制NF-κB活性抗炎症等生物学作用，猜测其可能具有抗心梗后交感神经重构的生物学作用。本文通过研究青蒿素对大鼠心梗后交感神经重构的作用并探索其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级健康成年雄性SD大鼠（购自华中科技大学同济医学院动物实验中心）合格证号601036，体质量为250～300 g。本实验遵循《实验动物保护条例》。

1.1.2 实验器材：小型动物呼吸机，江西省特立麻醉呼吸设备有限公司LEAD-2000B 32；导电生理记录仪，四川锦江电子设备有限公司；MILLI-Q超纯水纯化系统，美国Millipore有限公司；电泳转膜装置，美国 Bio-Rad有限公司；荧光倒置显微镜，德国Leica有限公司；VL凝胶成像分析系统，法国；蛋白印迹杂交系统，美国Bio-Rad有限公司；Olympas BX60光学显微镜，日本Olympas有限公司；冰冻超高速离心机，德国Heraeus有限公司。

1.1.3 主要试剂：戊巴比妥钠冻干粉，美国 Sigma公司 RNA抽提试剂盒（Trizol），北京万辉双鹤药业有限责任公司；青蒿素（H10970338），广西制药厂羧甲基纤维素钠（GB2760-2011），山东江北化工有限公司；RT-PCR试剂盒，美国Biosystem公司；GAP43兔抗大鼠多克隆抗体，美国Invitrogen公司；TH兔抗大鼠多克隆抗体，美国Sigma公司；NGF兔抗大鼠多克隆抗体，美国 Sigma公司；小鼠抗白介素 1β抗体，Abcam小鼠抗肿瘤坏死因子 α，Abcam抗 β-actin抗体。IL-1β的引物序列：F：5’-GGGATGATGACGACCTGC-3’，R：5’-CCACTTGTTGGCTTATGTT-3’；TNF-α的引物序列：F：5’-GCCACCACGCTCTTCTGTC-3’，R:5’GCTACGGGCTTGTCACTCG-3’； GAPDH 的 引 物 序 列 ： F： 5’-GCAAGTTCAACGGCACAG-3’， R：5’-CATTTGATGTTAGCGGGAT-3’。

1.2 方法

1.2.1 分组造模：70只大鼠随机分成3组，假手术组10只，心梗组30只，心梗治疗组30只。

大鼠心梗模型的造模步骤：大鼠按照30 mg/kg的剂量腹腔注射10%戊巴比妥钠；麻醉成功后将其四肢用橡皮筋固定于自制的手术台上，用小剪刀减去颈部和胸部的毛，四肢连接多道电生理记录仪电极，行心电监护；钝性分离颈部肌肉，暴露气管，将自制的气管插管针插入气管；将气管插管与小型动物呼吸机相连接，调节潮气量12 mL，呼吸比2∶1，频率70次/分；手术刀片沿左侧胸骨切开皮肤，伤口长约2.5 cm，钝性分离胸大肌，直至暴露肋骨，用2把止血钳将第4～5根肋骨咬断，注意防止肋间动脉出血，用开睑器将其撑开；用小剪刀剪开心包膜，充分暴露心脏；用棉签从左心耳处将心脏挑起，从肺动脉圆锥和左心耳之间，距离左心耳根部约2 cm处，结扎冠状动脉前降支，进针深度约0.5 mm，以6/0缝线穿过肌层，针尖穿出后小心抽出针，结扎缝线，观察心电图的变化，结扎线以下区域可见颜色变白，心肌收缩减慢，同时Ⅰ导联aVL导联ST段向上抬高，大于0.2 mV，并且可见频发的室性心律失常，以上提示结扎成功。留置排气导管置入心脏胸腔，逐层缝合肌肉和皮肤，用注射器抽吸胸腔内的积血和空气，最后拔除导管。术后腹腔注射青霉素40万单位，肌注1周；假手术组，开胸暴露心脏的方法同前，冠脉前降支下穿过结扎线，不缝合。

给药途径和时间：大鼠心梗后24 h，青蒿素溶解在0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，心梗治疗组按75 mg/（kg·d）的剂量分3次灌胃大鼠，每次间隔1天。心梗组和假手术组给予等量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，持续时间为4周，后将动物处死并按需要取材。

心梗面积计算：Masson染色后，心肌梗死区全部是胶原纤维，呈蓝色，心肌细胞被染成红色。病理专业图像分析软件Image-Pro Plus 6.0，计算左室梗死面积（梗死面积 = 梗死区心内膜长度/整个左心室心内膜长度）。

1.2.2 蛋白免疫印迹分析IKBα蛋白的表达：将150 mg左右的心肌组织放入匀浆器，同时加入组织裂解液1 mL，组织匀浆器彻底匀浆，4℃条件下，12000 r/min的速度离心15 min，将其上清液保存在－70℃条件下备用；加5 μL样品到96孔板样品孔，加标准品稀释液到20 μL；各孔中加入200 μL G250染色液，混匀后，室温下放置5 min；运用酶标仪测定各孔A595时的吸光值，并且该值作为Y轴，而蛋白浓度作为X轴，绘制曲线，根据曲线计算样品中蛋白浓度；SDS-PAGE电泳，200 mA 横流转膜，30～40 min；将NC膜放入TBST稀释的一抗中，在4℃条件下孵育过夜；TBST洗膜，每次10 min，共3次；将NC膜放入TBST稀释的二抗中，在4℃条件下孵育过夜；TBST洗膜，每次10 min，共3次；将ECL显影液（等量混合），孵育5 min（室温下），准备好保鲜膜和胶片（暗房里操作），准备曝光，曝光结束后取下胶片，显影定影各5 min，最后用自来水冲洗。蛋白免疫印迹定量分析：凝胶成像分析系统对胶片进行扫描，Bandscan 软件对图像条带作半定量分析，以内参β-actin的条带吸光值作为参考标准。目的条带和β-actin的条带吸光值的比值作为钙蛋白表达相对量。

1.2.3 免疫组织化学分析 TH和GAP43染色的阳性神经纤维密度：心肌组织标本经多聚甲醛浸泡后，石蜡包埋处理，5 μm厚度切成片；对组织进行脱蜡，切好的组织切片进行水化；3%的双氧水，室温下灭活5～10 min，蒸馏水冲洗3次；用正常血清工作液封闭，将内源性过氧化物酶活性灭活，室温条件下孵育10 min；将血清甩去，滴加GAP43指标的兔抗大鼠抗体GAP43，0.05 mL，37℃条件下孵育2 h；PBS洗涮3次，每次约3～5 min；滴加稀释10倍二抗生物素标记羊抗兔IgG10%，0.05 mL，37℃条件下孵育10～15min；PBS洗3次，每次约3～5 min；滴加辣根酶链霉素工作液，37℃条件下孵育10～15 min；PBS洗3次，每次约3～5 min；DAB显色；自来水冲洗；苏木素染色；梯度酒精脱水；二甲苯透明处理；最后用中性塑胶来封片；最后，对TH和GAP43染色的阳性神经纤维进行密度分析，其具体方法参照文献[6]。

1.2.4 NGF蛋白表达检测：使用免疫组化SABC方法检测、心肌组织炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平用RTPCR检测，取心肌组织100 mg剪碎，用Trizol法提取总RNA。按照试剂说明进行RT-PCR反应。以GAPDH为内参照，采用2-CT方法分析目标基因的相对表达量。免疫组织化学检测梗死周边区巨噬细胞数目。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 心梗模型与心梗面积

心梗后4周，假手术组死亡1只，存活率为90%；心梗组死亡18只，存活率为40%；心梗治疗组死亡10只，存活率67%。经Masson染色和病理分析，心梗组和心梗治疗组心梗面积分别为（34.50 ± 2.36）%、（33.77 ± 4.05）%，心梗组和心梗治疗组之间的心梗面积没有统计学差异。

2.2 交感神经纤维的分布和密度

本研究观察青蒿素对大鼠心梗后GAP43和TH阳性交感神经纤维的分布及密度。研究发现心梗后梗死周边区，GAP43和TH阳性交感神经纤维分布紊乱，直径粗乱，纤维密度高，见图1。心梗组与假手术组相比，GAP43和TH阳性交感神经纤维密度显著增加（P<0.05）。心梗治疗组GAP43和TH阳性交感神经纤维密度比心梗组显著降低（P<0.05），见表1。

2.3 RT-PCR检测心肌组织炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平

青蒿素具有抗炎症的作用，本研究通过RTPCR检测梗死周边区心肌组织炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平。研究表明，与假手术组相比，心梗组梗死周边区TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平显著增加（P<0.05），与心梗组相比，心梗治疗组炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平显著降低（P<0.05），见表2。

2.4 蛋白免疫印迹检测IKBα蛋白的表达

心梗后4周，本研究通过蛋白免疫印迹的方法检测梗死周边区IKBα蛋白的表达，结果发现心梗组IKBα蛋白比假手术组要高（P<0.05），青蒿素治疗可以显著减小IKBα蛋白表达（P<0.05），见表3。

2.5 蛋白免疫印迹检测NGF、GAP43、TH蛋白的表达

心梗后4周，心梗组梗死周边区NGF蛋白的表达显著高于假手术组，青蒿素治疗可以显著减少NGF蛋白的表达水平。心梗组梗死周边区的心肌组织中GAP43和TH蛋白表达含量显著高于假手术组，而青蒿素治疗后表达显著减少（P<0.05），见图2、表4。

2.6 免疫组织化学检测梗死周边区巨噬细胞数目

巨噬细胞在心梗后交感神经重构中起重要作用，本研究发现心梗后4周，梗死周边区巨噬细胞数目比假手术组高，而青蒿素治疗可以有效降低梗死周边区巨噬细胞数目（P<0.05），见图3、表5。

3 讨论

青蒿素是一种从菊科植物黄花蒿中提取的具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物，是世界卫生组织公认的抗疟疾药物[10]。现代医学研究发现，青蒿素除了抗疟疾之外，还存在其它生物学作用，如免疫调节、抗炎症、抗纤维化等[11-12]。本研究发现青蒿素抑制大鼠心梗后交感神经再生，同时缓减心梗后梗死周边区炎症反应，减少神经生长因子以及炎症介质的表达。本研究发现青蒿素治疗可以显著减少心梗后梗死周边区炎症因子的表达和炎症细胞的数目，同时还发现青蒿素治疗可以抑制核因子KB的激活，主要通过抑制IKB蛋白的磷酸化。炎症细胞在心梗后NGF的合成中起着重要的作用[13-15]。Hasan等研究发现梗死周边区NGF表达显著高于非梗死区，而且梗死周边巨噬细胞和肌纤维母细胞数目很高，这些结果提示炎症细胞可能是NGF的重要来源[3]。而本研究发现心梗后4周，青蒿素治疗组梗死周边区心肌组织的NGF浓度和巨噬细胞数目都显著低于对照组。这些结果表明，青蒿素降低心肌组织中的NGF浓度可能是通过减少心肌组织中巨噬细胞数目实现的。青蒿素治疗可以显著缓减梗死周边区交感神经再生降低梗死周边区心肌组织中NGF的浓度，这些结果提示抑制心梗后心肌组织中NGF的表达可能是青蒿素减缓心梗后交感神经重构的主要机制。

综上所述，本研究首次报道青蒿素可以抑制心梗后交感神经重构，而且其机制可能是通过抑制心梗后炎症反应，该研究为临床运用青蒿素治疗心梗后交感神经过度再生提供了理论依据。鉴于交感神经重构与心律失常的发生密切相关，因此我们推测青蒿素可能为临床治疗心梗后恶性室性心律失常提供了新的选择。

摘编自《中国生化药物杂志》2015年第1期：81～84页，图、表、参考文献已省略。