青蒿素和桦木酸阻断脂多糖诱导小鼠血管新生及组织增殖

高倩，吴佩，何疆，曾庆平

（1.广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405；2.广东省第二中医院，广州 510095）

青蒿素和桦木酸阻断脂多糖诱导小鼠血管新生及组织增殖

高倩1，吴佩2，何疆1，曾庆平1

（1.广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405；2.广东省第二中医院，广州 510095）

炎症与肿瘤之间关系密切，促炎细胞因子是肿瘤微环境（niche）的重要组成部分[1]。以细菌性炎症为例，由幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）引起的胃黏膜上皮细胞感染可导致慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤和胃癌[2]。为此，国际癌症研究理事会（IARC）于1994年将幽门螺杆菌确定为Ⅰ类致癌剂[3]。然而，迄今为止对于幽门螺杆菌如何通过慢性炎症诱发胃癌的分子病理机制尚不清楚。

幽门螺杆菌属于革兰阴性细菌，其外膜含有脂多糖（LPS），可结合细胞表面Toll样受体4（TLR4）[4]。TLR4不仅分布在胃上皮细胞表面，也存在于胃癌细胞表面。有研究指出，幽门螺杆菌与大肠杆菌的LPS可循LPS-TLR4途径促进胃癌细胞生长[5]。因此，有人认为幽门螺杆菌的LPS可能是诱发慢性胃炎乃至胃癌的重要因素[6]。

胶原Ⅱ-完全弗氏佐剂（CⅡ-CFA）诱导小鼠关节滑膜炎的组织病理学图谱显示，滑膜组织呈现类似肿瘤的血管新生与组织增殖特征，并伴有淋巴细胞浸润现象[7]。巧合的是，CFA就含有结核分枝杆菌LPS成分。既然滑膜炎伴随肿瘤样增殖，那么抗肿瘤药物就能阻断此过程。以往研究证明，细胞凋亡诱导剂植醇[8]以及免疫抑制剂西罗莫司[9]和抗疟药青蒿素[10]既具有抗肿瘤作用，也表现滑膜炎治疗效果，提示滑膜炎的血管新生与组织增殖可以模拟肿瘤样病变的早期过程。在前期工作中，我们根据滑膜炎发病过程中促炎细胞因子表达上调、一氧化氮（NO）爆发、缺氧、血管新生和组织增殖等观察结果，提出了“炎症激发NO驱动缺氧致瘤”假说，试图揭示炎症诱发肿瘤的中间环节[11]。随后，有人提供了支持该假说的实验证据，即缺氧可促进快速生长的细胞转变成癌细胞，因为它能激活DNA损伤紧急修复机制，促进基因突变、抑制细胞凋亡和启动血管新生[12]。

本实验拟利用LPS及含LPS的CFA建立小鼠皮下组织及滑膜肿瘤样增殖模型，并对致瘤相关生理病理变化进行形态学（表型描述及炎症分级）与组织化学（血管新生与组织增殖及淋巴细胞浸润）鉴定，依时测定NO、血氧饱和度（SpO2）和3-硝基酪氨酸（3NT）的血清浓度，对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达水平进行免疫组化分析，以探讨LPS促进肿瘤样增殖的分子机制。同时，基于上述测定指标，初步评价青蒿素和桦木酸单用及合用抑制肿瘤样增殖的早期防控效果。

1 材料

1.1 试剂与药品

LPS、CFA、桦木酸、NG-甲基-L-精氨酸（LNMMA）（Sigma公司）。硝普钠（SNP，北京双鹤现代医药技术有限公司）。青蒿琥酯（桂林南药股份有限公司）。NO 测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。小鼠3NT ELISA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）。抗HIF-1α、VEGF、iNOS一抗及酶标二抗（广州中医药大学附属第一医院病理科）。

1.2 仪器

MIAS显微图像分析系统（北京炳洋科技有限公司）。MK3 酶标仪[美国热电（上海）科技仪器有限公司]。MD300C 指甲式脉搏血氧仪（北京超思电子技术有限责任公司）。

1.3 实验动物来源及实验环境

SPF级昆明小鼠，雄性，4周龄，18～22 g（广州中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK粤2008-0020）。本实验涉及的动物实验已获本校实验动物伦理委员会批准（批准号：SPF-2011007）。

2 方法

2.1 滑膜肿瘤样增殖模型

CFA造模组：用500 μg·mL-1CFA注射后腿踝关节腔，每只200 μL，1周后再注射1次；LPS造模组：用100 μg·mL-1LPS按每只每天200 μL 注射后腿踝关节腔，注射1周；SNP模拟造模组：用100 μg·mL-1SNP 按每只每天200 μL注射后腿踝关节腔，注射1周；L-NMMA干扰造模组：在注射相应造模试剂的同时，用500 μg·mL-1L-NMMA溶液按每只每天200 μL注射后腿踝关节腔，共两周。每组5只小鼠。

2.2 皮下组织肿瘤样增殖模型

小鼠背部剃毛，用手术线绑扎皮肤使其隆起，分为CⅡ-CFA/CFA造模组：每只用1 mg·mL-1CⅡ-CFA 或2 mg·mL-1CFA注射200 μL，1周后再注射1次；SNP模拟造模组：每只用10、50或100 mg·mL-1SNP 每天注射200 μL，连续注射两周；CⅡ-CFA/CFA+SNP复合造模组；用100 μg·mL-1SNP每只每天注射200 μL，连续注射两周，同时每只用1 mg·mL-1CⅡ-CFA或2 mg·mL-1CFA注射200 μL，1周后再注射1次。每组5只小鼠。

2.3 腿部炎症分级

采用0～4分制：0=正常；1=一趾或多趾红肿；2=自踝关节至中爪（跗骨）发红并中度肿胀；3=自踝关节至中跗骨关节发红并重度肿胀；4=踝、爪、趾全部红肿，关节变形和僵硬。

2.4 治疗方案及给药方式

LPS造模组及SNP造模组的治疗是在造模第4天用青蒿琥酯关节腔注射或皮下注射、桦木酸灌胃或关节腔注射或皮下注射、青蒿琥酯与桦木酸合用，用药两周；CFA造模组的治疗是从造模第2天开始治疗，用药两周。灌胃给药每只每天500 μL，注射给药每只每天200 μL。

2.5 NO、SpO2和3NT测定

血清NO测定按测试盒说明书操作，SpO2采用血氧仪测量，将小鼠后腿插入橡胶孔道，松开夹子，按面板上开关按钮，从显示屏直接读取数据。3NT测定样本分别取自血清和注射部位（后腿）肌肉，测定采用酶联免疫吸附法，按说明书操作，最后根据标准曲线求出实际含量或浓度。

2.6 病理学分析

将福尔马林固定和石蜡包埋的关节组织（含滑膜及软骨）切成3 μm薄片，用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、蒸馏水洗涤。经苏木精染色后，用体积分数分别为1%酸性乙醇分化、1%氨水返蓝、95%乙醇冲洗。用伊红染色后，经梯度乙醇脱水和二甲苯清洗，用含二甲苯的封片液封片。在显微镜下观察并拍摄组化染色切片的滑膜增殖、滑膜下组织纤维化、淋巴细胞浸润等病理变化。

2.7 免疫组化分析

将福尔马林固定的关节组织（含滑膜及软骨）进行免疫组化分析。将石蜡切片与3% H2O2在室温下共育，抑制内源性过氧化物酶。用煮沸的柠檬酸修片、磷酸缓冲液（PBS）洗涤、2%牛血清白蛋白（BSA）封片后，与1∶100稀释的一抗在37℃下保温1 h。将玻片用PBS洗涤，与生物素化二抗在37℃下保温20 min。用PBS洗涤，与二氨基联苯胺（DAB）保温1～5 min。经冲洗、苏木精复染、脱水、清洗和封片后，用 MIAS显微图像分析系统进行定量检测，由下式计算结果：免疫组化强度=阳性目标总面积/统计场总面积（面密度）×阳性目标的阳性单位。

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 小鼠皮下组织增殖诱导及模拟的形态学观察

为了观察滑膜炎诱导剂CⅡ-CFA/CFA及其模拟剂SNP促进皮下组织增殖的效果，利用不同浓度及不同组合的CⅡ-CFA/CFA或SNP，在小鼠背部绑扎后的隆起部位进行肌肉注射，其皮下组织的外观形态见图1。

从图1可见，各造模组均出现不同程度的实体增殖，其中CFA造模组的瘤状增殖明显，未出现组织坏死现象（图1A、B、C）；CⅡ-CFA/CFA造模组可观察到局部小面积坏死结痂（图1E、G）；SNP + CⅡ-CFA/CFA造模组则有大面积坏死或全部坏死，瘤状块偏小（图1F、H）。对照小鼠的上皮组织为一平整薄片，无增殖现象（图1D）。

3.2 小鼠皮下组织增殖诱导及模拟的病理学分析

为了从细胞水平上进一步确认上述皮下组织的瘤状增殖形态，对来自不同造模组增殖组织的切片进行苏木精-伊红（HE）染色和病理学分析，结果见图2。

从图2可见，对照组皮肤的表皮、真皮及皮下组织结构正常，肌肉深部组织为疏松的结缔组织，未见炎细胞浸润及毛细血管扩张充血（图2D）。在SNP模型中，低浓度组的肌肉深部见纤维组织和毛细血管轻度增殖（图2A）；中浓度组见纤维组织轻度增殖，但出现大量毛细血管增殖并扩张充血（图2B）；高浓度组的肌肉深层纤维组织及组织细胞、毛细血管明显增殖，大量中性粒细胞浸润，并有一处大的脓肿坏死灶形成（图2C）。在CⅡ-CFA和CFA模型中，均出现纤维组织和毛细血管增殖及中性粒细胞浸润，但CFA组的血管增殖明显并扩张充血（图2E、F），而CⅡ-CFA组则出现大面积坏死（图2G、H）。

3.3 内外源NO对组织供氧状况的影响

由形态学和病理学结果可知，CⅡ-CFA/CFA 可诱导血管新生和组织增殖，而SNP可模拟CⅡ-CFA/CFA的上述作用。前期研究已证明，CⅡ-CFA/CFA可诱导NO合成（内源NO），而SNP可释放SNP（外源NO），由此产生的过量NO能引起关节滑膜缺氧[8,12]。为了阐明内外源NO浓度与皮下组织供氧状况的关系，测定了各组不同处理小鼠的血清NO浓度和增殖部位的SpO2，结果见表1。

表1数据显示，SNP、CⅡ-CFA/CFA 均使NO升高，由高到低依次为CFA>CⅡ-CFA>SNP + CFA>100 μg·mL-1SNP>10 μg·mL-1SNP>SNP+CⅡ-CFA>50 μg·mL-1SNP。高浓度SNP、CⅡ-CFA/CFA均使SpO2降低，由低到高排列为CFA>SNP+CFA>SNP（100 μg·mL-1）>SNP+CⅡ-CFA>CⅡ-CFA>SNP（50 μg·mL-1）>SNP（10 μg·mL-1）。对两组数据进行Spearman相关分析，得出相关系数=－0.7440，0.02

由于合用或单用的注射量都是200 μL，故合用时CII-CFA或CFA的用量减半，而CII-CFA或CFA诱导的NO多于SNP诱导的NO，所以出现合用组NO含量低于单独用药组的现象。

3.4 小鼠滑膜增殖诱导及阻遏的形态学及病理学

比较为了直接观察LPS对肿瘤样增殖的诱导作用，用100 μg·mL-1LPS注射小鼠后腿踝关节，连续注射3 d后分析其滑膜组织的外观形态及组织病变，结果见图3。由图3可以看出，对照组的关节形态及滑膜显微结构均正常（图3A、a）。经LPS注射后，小鼠关节也像注射CⅡ-CFA/CFA那样出现红肿，但炎症程度仅为2级（图3B）。病理分析结果显示，LPS注射小鼠的滑膜轻度增殖，并出现少量炎症细胞浸润（图3b）。LPS注射小鼠的血清NO 升高，滑膜SpO2则降低，但同时注射L-NMMA后，NO明显下降，SpO2则相应回升，结果见表2。经LPS注射后，NO与SpO2成负相关，结果与CⅡ-CFA/CFA造模一致。对血管新生基因表达水平的分析表明，LPS造模组与对照组比较，HIF-1α、VEGF表达上调近10倍，iNOS表达上调约7倍。LNMMA处理使HIF-1α、VEGF、iNOS表达全部下调（表3）。

3.5 NO对蛋白质硝化的影响

蛋白质硝化的主要产物是3NT，而催化这一反应的是NO与超氧阴离子作用产生的过氧化亚硝酸阴离子（ONOO－）。为了探讨CⅡ-CFA/CFA激发的过量NO对蛋白质硝化的影响以及SNP的模拟及L-NMMA的阻遏，测定了不同处理小鼠血清3NT浓度，结果见图4。

从以上结果可知，CⅡ-CFA/CFA处理组的3NT浓度比对照（图4A）均有不同程度提高（图4B、C），提示免疫激活诱生的NO和O2

－可通过ONOO－促进蛋白质硝化。若同时注射CⅡ-CFA/CFA与LNMMA，CⅡ-CFA+L-NMMA处理组的3NT浓度与图4B中CⅡ-CFA处理比较未见降低（图4D），CFA + L-NMMA处理组的3NT浓度则比图4C中CFA处理明显降低（图4E）。若SNP单用或与CⅡ-CFA/CFA联用，其3NT浓度均较低，与对照相比差异不显著（图4F、G、H），表明SNP不能导致蛋白质硝化，原因可能是它只释放NO但并不诱生O2－，故不能产生ONOO－。

以上测定结果均来自血液样本，为了在肌肉组织中验证NO与蛋白质硝基化的动态关系，对每日注射LPS的小鼠血清中NO与后腿注射部位肌肉中3NT进行了较长时间的跟踪测定。结果表明，NO与3NT同步变化，即蛋白质硝基化程度随NO含量的升降而波动。在LPS注射后3 d测得的NO与3NT最高，随后逐渐降低，至14 d时双双降至对照水平（图5）。

以上结果进一步证实，蛋白质硝基化程度与NO成正比，而NO取决于iNOS被TNF-α、IL-1等促炎细胞因子诱导表达的程度[12]。因此，免疫激活介导的炎症可导致蛋白质硝基化，但尚不清楚多次注射LPS后NO与3NT下降的原因，推测可能与多次注射诱导抗LPS抗体的中和作用有关。

3.6 青蒿琥酯和桦木酸对NO驱动缺氧的影响

采用LPS或CFA造模，其中LPS连续注射3 d后开始给药，CFA注射后第2天开始给药，均采用关节腔直接注射给药。用药两周后分别测定关节部位SpO2及血清NO，结果见表4和图6。

从表4和图6可见，SpO2与NO反相关，LPS与CFA造模组两指标与对照组比较差异极显著，CFA模型的缺氧程度更甚。从造模组的治疗效果来看，青蒿琥酯与桦木酸单用及合用，SpO2都明显升高，NO明显降低，与造模组比较差异显著。LPS模型治疗组显示两药合用缓解缺氧的效果更好，而CFA模型治疗组单用与合用效果无差异。

3.7 青蒿琥酯和桦木酸对滑膜肿瘤样增殖的影响

为了确定青蒿琥酯、桦木酸抑制肿瘤样增殖的效果，对LPS模型治疗组及CFA模型治疗组小鼠分别进行了病理学分析，结果见图 7。结果表明，模型小鼠滑膜组织大量增殖，出现血管新生，炎症细胞浸润，嗜酸粒细胞（EOS）多见。青蒿琥酯与桦木酸单用或者合用治疗后，增殖程度减轻，炎症细胞少见，合用效果优于单用。

为了深入研究青蒿琥酯与桦木酸抑制滑膜组织肿瘤样增殖的机制，对各组小鼠滑膜细胞中HIF-1α、VEGF和iNOS等血管形成相关因子的表达水平进行了免疫组化分析，结果见表5。

表5所示结果表明，LPS与CFA造模组HIF-1α、VEGF、iNOS大幅度上调，与对照比较差异极显著。经青蒿琥酯和桦木酸治疗后，HIF-1α、VEGF、iNOS出现不同程度下调。LPS模型中，HIF-1α下调程度由高到低为：桦木酸与青蒿琥酯合用>桦木酸单用>青蒿琥酯单用，VEGF与iNOS下调程度依次为：桦木酸单用>合用>青蒿琥酯单用；CFA模型中，HIF-1α与iNOS下调程度依次为：青蒿琥酯单用>合用>桦木酸单用，VEGF下调程度依次为：合用>青蒿琥酯单用>桦木酸单用。

4 讨论

LPS是革兰阴性细菌的细胞壁成分，其化学本质是磷脂多糖-蛋白质复合物，其类脂质 A对宿主有毒性，称为内毒素（endotoxin）。内毒素可激活人体内的单核巨噬细胞和血管内皮细胞，使其产生大量炎性介质，如TNFα、IL-6、IL-1等促炎细胞因子[13]，同时还能诱导iNOS高表达产生大量NO，引起一系列病理反应[14]。以往研究还表明，内毒素休克病人体内的NO水平显著升高[15]。LPS或LPS/干扰素-γ（IFN-γ）是NO合成的强力诱导剂[16]。本实验也发现，LPS诱导的过量NO源于iNOS的过表达。因此，LPS介导炎症的后果之一就是NO爆发。

NO有“双刃剑”之称，其作用取决于它的来源及其浓度。一方面，由神经元NOS（nNOS）及血管内皮细胞NOS（eNOS）合成的适量NO，通过激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC），导致环尿苷酸（cGMP）水平提高，促进cGMP依赖性蛋白激酶活化和离子通道开放，发挥信号转导和血管调节等重要生理功能[17]。另一方面，受内毒素、TNFα、IL-1、IL-2等刺激，由iNOS合成的过量NO 既担负着杀灭病原体的重任，也是引起某些疾病如败血症、感染性休克、多脏器功能衰竭的重要介质[18]。

NO爆发可造成生物组织、细胞和分子的自我损伤，其机制包括：① NO可跨膜进入线粒体内结合细胞色素C氧化酶（复合物Ⅳ），抑制呼吸链功能，导致代谢性缺氧[19]。氧分压与滑膜炎之间存在直接相关性，缺氧是滑膜炎的驱动因素之一[20]。② NO能与O2－结合形成ONOO－，而后者又可与H+形成不稳定的过氧化亚硝酸（ONOOH），并很快分解成活性氮产物NO2－和活性氧产物OH－等。这些强氧化剂的过量产生可导致蛋白质中氨基酸的化学修饰，如酪氨酸3-硝基化、半胱氨酸S-硝基化等。大鼠胎粪诱导肺损伤时，肺组织的iNOS表达上调导致3NT含量升高[21]。本实验也发现，NO与3NT之间呈现对应关系，NO水平越高，3NT含量也越高。

在缺氧条件下，HIF-1α与VEGF表达均被上调，血管形成过程被启动[22]，可促进血管新生、细胞黏附和侵袭[23]。血管新生还会影响体内的代谢活动，尤其是有氧分解与无氧分解的转换。例如，血管新生前后血清中的乳酸含量出现先升后降的变化[8,12]。至于组织增殖的发生机制，目前还不清楚。最新证据显示，诱导多能干细胞（iPSC）中 DNA甲基化模式的改变可能诱发肿瘤样病变，即iPSC相关的肿瘤起源可能受表观遗传模式控制[24]。

青蒿琥酯具有抗肿瘤作用，也有一定的免疫抑制作用，并显示抑制新生血管形成[25]。青蒿琥酯通过下调血管内皮细胞VEGF表达，能有效抑制新生血管生长[26]。青蒿琥酯对慢性髓样白血病小鼠肿瘤的影响包括降低VEGF表达水平和抑制肿瘤生长速率[27]。青蒿琥酯对LPS或LPS合并干扰素诱导的NO合成均有明显的抑制作用，其抑制作用具有特定的量效关系[28]。青蒿琥酯通过结合NOS的血红素辅基抑制NO合成，从而阻断NO介导的血管新生作用[29]。本实验制备的肿瘤样增殖模型是基于NO驱动缺氧诱导的血管新生和组织增殖，因而青蒿琥酯是首选的针对性治疗药物。

桦木酸的抗肿瘤活性最初是在黑色素瘤细胞中确定的，后来的研究显示桦木酸对儿童恶性脑瘤细胞及多种神经瘤细胞均有抑制作用[30-31]。桦木酸在1.25～10 μg·mL-1内，能显著提高正常小鼠腹腔巨噬细胞NO生成水平，但剂量过大（20 μg·mL-1）则抑制NO生成[32]。桦木酸可通过诱导巨噬细胞表达iNOS 产生大量NO，这可能是其增强机体免疫功能、抑菌、抗病毒的作用机制之一[33]。在分子水平上，桦木酸可抑制缺氧响应因子HIF-1α的转录，后者再通过抑制STAT3和HIF-1α与VEGF基因启动子的结合抑制血管生成[34-35]。本实验结果也显示，桦木酸可下调HIF-1α、VEGF、iNOS表达，通过减少NO的产生发挥抗缺氧诱导作用。

由此可见，青蒿琥酯与桦木酸的作用机制不完全相同，前者通过抑制NOS活性直接切断NO来源，后者可抑制HIF-1α的转录，进而抑制HIF-1α与VEGF启动子结合来减少新生血管形成。本实验表明，青蒿琥酯和桦木酸可以不同程度地改善NO诱导爆发性缺氧导致的滑膜肿瘤样增殖和炎症细胞浸润，联用比单用的效果更佳，其联合治疗方案值得开展临床应用评价。此外，NO供体化合物SNP 可以模拟肿瘤样增殖，而NO合成抑制剂L-NMMA则阻断肿瘤样增殖。这从另一个侧面证实过量NO驱动的缺氧效应可能是肿瘤发生的重要启动因素之一。

摘编自《中国药学杂志》2015年第4期：330～338页，图、表、参考文献已省略。