青蒿素对实验性糖尿病大鼠肾脏蛋白激酶C移位活化的抑制作用

张丽坤，张建勇，周凤娇，苏彦君，安志霞

（河北省石家庄市第二医院，石家庄 050051）

青蒿素对实验性糖尿病大鼠肾脏蛋白激酶C移位活化的抑制作用

张丽坤，张建勇，周凤娇，苏彦君，安志霞

（河北省石家庄市第二医院，石家庄 050051）

高糖环境引起肾脏细胞蛋白激酶C（PKC），从细胞浆转移到细胞膜，即PKC发生移位活化，导致转录因子活化蛋白-1（AP-1）和核因子-κB（N-κB）等磷酸化激活，使其调控的下游基因表达上调，大量细胞因子和生长因子产生增加，引起糖尿病肾病（DN）的发病及其病情发展[1-3]。在DN的发生发展中，PKC的移位活化起关键作用[3-4]。如何通过调控PKC的移位活化以阻止DN的发病成为目前研究的焦点之一。本实验采用青蒿素对糖尿病大鼠模型行腹腔注射，并监测其对肾脏PKC活性的影响，旨在为临床寻找防治DN的有效干预措施提供实验依据。

1 实验资料

1.1 动物分组及模型制备

36只雄性SD大鼠，购自河北医科大学实验动物部，体质量180～220 g，将大鼠随机分为3组：正常对照组（A组）、糖尿病非治疗组（B组）及糖尿病青蒿素治疗组（C组），每组12只大鼠。B组、C组利用大鼠单剂量腹腔注射STZ（购自Sigma公司）65 mg/kg建立糖尿病大鼠模型。A组只腹腔注射等剂量柠檬酸缓冲液。72 h后经尾静脉采血，使用达优血糖仪（广州达优医疗设备有限公司生产）检测大鼠血糖，以血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠模型制备成功。

1.2 动物给药

A组以青蒿素（购自成都伟辉生物科技有限公司）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，自糖尿病大鼠模型成功当天起腹腔注射，青蒿素剂量300 mg/（kg·d）。A组与B组大鼠分别给予等剂量DMSO溶液腹腔注射。所有实验大鼠均自由进食、饮水，不使用任何降糖药物。

1.3 收集标本

在实验进行到第3周、第6周时，各组分别宰杀6只大鼠进行相关指标检测。大鼠宰杀前1 d收集24 h尿液后分别取6 mL，测尿肌酐、UAER。宰杀后称大鼠质量；取血5 mL，测定血肌酐、尿素氮及血糖；取双肾称质量，取右肾部分皮质放于10%甲醛溶液中浸泡、固定，以备光学显微镜检查；另外，取右肾部分皮质放液氮中保存，测肾组织细胞膜及细胞浆的PKC活性。

1.4 测定肾组织细胞膜及细胞浆的PKC活性

1.4.1 提取细胞膜及细胞浆蛋白产物

在冰上进行所有操作以保持PKC活性剪碎所保存的肾组织后放于其5倍体积的缓冲液A（pH 7.5，20 mmol/L Tris/HCl，2 mmol/LEDTA，0.25 mmol/L Sucrose，10 mmol /L EGTA）中，用组织匀浆器制作匀浆，4℃环境中100000 g加速度离心1 h，所得上清液即为肾细胞浆蛋白成分，其内含有细胞浆中的PKC。将其沉淀物中加入1 mL缓冲液B（缓冲液A中加入1% TritonX-100），抽提30 min，每间隔10 min震荡1次，在4℃环境下100000 kg加速度离心1 h，所得的上清液即为肾组织细胞膜蛋白成分，其中含有细胞膜PKC。

1.4.2 测定肾组织细胞膜及细胞浆的PKC活性

应用ELISA方法测定肾组织细胞膜及细胞浆的PKC活性（试剂盒购自Promege公司），操作步骤均按照说明书要求进行。

1.5 检测生化指标

采用放免法检测实验大鼠尿白蛋白含量。用日产奥林巴斯AU400全自动生化分析仪检测所有生化指标，并计算内生肌酐清除率（CCr），其结果用大鼠体质量进行校正。

1.6 肾组织病理学检查

常规制作光镜切片后做HE染色，并行六胺银及PAS染色。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠血糖、肾脏质量、体质量及肾脏系数的变化

大鼠腹腔注射链脲佐菌素后72 h血糖≥16.7 mmol/L，表明糖尿病大鼠模型制备成功。同期各组实验数据相比，B组大鼠体质量均明显低于对照组（P<0.05或0.01），并随时间延长体质量逐渐下降，肾脏系数、肾脏质量均逐步增加，与A组比较有明显差异（P<0.05）。C组大鼠体质量均明显高于B组（P<0.05），肾脏系数、肾质量均低于糖尿病非治疗组（P<0.05）。见表1。

2.2 各组UAER及肾功能比较

B组大鼠血尿素氮、内生肌酐清除率及UAER 明显高于同期A组大鼠（P<0.05或0.01）。C组大鼠上述数据与同期非治疗组大鼠相比明显降低（P<0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠肾组织细胞PKC活性变化的比较

与A组相比较，B 组大鼠肾脏组织细胞膜PKC活性逐步上升，而其胞浆PKC活性明显下降，2组比较均有显著性差异（P<0.05或0.01）。相关分析表明，B组大鼠肾组织细胞膜PKC活性的增加与UAER、肾脏系数均呈显著相关（r=0.613，P<0.01；r=0.975，P<0.05）。C组大鼠肾脏组织细胞膜PKC活性与对照组大鼠相比明显增加（P<0.01），但较同期B组大鼠明显下降（P<0.01）。见表3。

2.4 各组肾组织病理学变化

PAS及六胺银染色切片表明：B组大鼠肾小球PAS红色染色区及银染区均逐步增大。随着时间延长，肾小球基底膜逐渐增厚，系膜区逐渐增宽，证明肾小球病变呈进行性进展。C组大鼠肾脏病变较同期B组明显改善。

3 讨论

PKC是一组丝/苏氨酸蛋白激酶，在人体各种组织细胞内广泛存在。PKC是细胞内信息网络系统的重要组成部分，在细胞内信号转导通路中处于的核心位置，广泛调节多种细胞的生理生化功能，并在糖尿病肾病的发病及病情进展处于关键位置。PKC在各种组织细胞浆中以非活性形式存在，其发挥作用时需以活性形式从胞浆转移到细胞膜上，此即PKC的移位活化。高糖环境最终引起肾脏组织细胞PKC由细胞浆到细胞膜的移位活化，进而磷酸化激活转录因子，如AP-1和NF-κB，最终启动其调控的下游基因进行转录，这样就使肾细胞产生大量生长因子和细胞因子，启动糖尿病肾病的发病及病情发展[3-4]。所以在糖尿病肾病的发生及病情进展中，PKC移位活化处于核心位置。

近年来大量研究证实青蒿素药理作用广泛，主要包括抗肿瘤、抗炎、抗纤维化、抗氧化等作用[5-6]。本实验证明青蒿素能减轻糖尿病大鼠肾小球肥大，改善糖尿病大鼠肾脏功能，降低UAER，减轻糖尿病肾病早期肾脏病理病变，这主要通过抑制糖尿病大鼠肾脏组织细胞蛋白激酶C从胞浆到胞膜的移位活化得以实现。且青蒿素的上述肾脏保护作用与代谢因素无关，是因为糖尿病非治疗组大鼠与青蒿素治疗组大鼠血糖无统计学差异。总之，糖尿病大鼠腹腔注射青蒿素可有效抑制糖尿病大鼠肾脏组织细胞PKC由胞浆到胞膜的移位活化，从而显著改善糖尿病大鼠早期肾脏病理学改变，为临床成功防治糖尿病肾病提供了翔实的实验依据及可靠的研究手段。

摘编自《现代中西医结合杂志》2014年第18期：1964～1966页，图、表、参考文献已省略。