青蒿素对山羊瘤胃发酵和微生物氮素微循环的影响

王洪荣，秦韬，王超

（1.扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009；2.江苏大学临床医学院，镇江 212013）

青蒿素对山羊瘤胃发酵和微生物氮素微循环的影响

王洪荣1，秦韬1，王超2

（1.扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009；2.江苏大学临床医学院，镇江 212013）

0 引言

青蒿素为菊科植物青蒿的主要活性成分之一，具有高效低毒的抗疟、抗肿瘤和抗血吸虫等功效。青蒿是中国传统中药材之一,它主要生长在西南地区。青蒿素类药是中国科学家利用传统中草药自主研制的抗疟特效药。它也是一种天然绿色的提取物，其自身具有抗寄生虫、提高免疫力的功能。青蒿素也可以作为一种绿色饲料添加剂应用于畜牧业生产。近年来，在动物生产上将它主要用作抗寄生虫药物[1]，在家禽饲养上主要用于抗球虫。戴和斌等报道高剂量或中剂量青蒿素对球虫有高效的抗性[2]。潘存霞等研究表明，在兔日粮中添加青蒿提取物能明显提高幼兔的生长速度[3]。秦韬等在国内首次采用人工瘤胃法研究了青蒿素对山羊瘤胃发酵参数、原虫数量及产气量的影响，发现青蒿素可调控瘤胃中原虫数量和氨态氮浓度[4]。目前，中国在发展反刍动物生产中，一方面受到蛋白质饲料资源紧缺的限制，另一方面也存在反刍动物对含氮资源利用效率偏低的问题。因此，通过瘤胃调控最大限度地提高反刍动物体内氮素利用效率，减少饲料中氮源随动物粪、尿的排出数量，提高动物对饲料蛋白的利用效率是反刍动物生产的重要课题。鉴于目前国内外对茶皂素、丝兰皂苷等植物提取物作为反刍动物的瘤胃调控剂进行了许多研究[5-7]，但对青蒿素在反刍动物中应用研究很少，而它又是一种非常有潜力的瘤胃发酵调控剂。因此，本研究探讨青蒿素对反刍动物瘤胃发酵、瘤胃内环境及其瘤胃微生物蛋白质循环等影响。确定青蒿素对反刍动物瘤胃发酵调控作用的效果和适宜添加量，为青蒿素作为一种新的提高饲料蛋白质利用效率的瘤胃调控剂在反刍动物生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

本试验于2010年4月在扬州大学实验农牧场进行。

1.1 试验材料

选用4只健康、体重为（23.3±0.6）kg安装永久性瘤胃瘘管的成年徐淮白山羊羯羊，统一驱虫，单圈饲养，每日按体重的2%干物质量给料，每日8:00和20:00分两次等量饲喂，自由饮水。饲喂由用玉米和豆粕为主要原料组成的混合精料，以羊草为粗饲料，按精粗比为2∶8配制饲粮，具体配方为玉米11.05%，豆粕5.95%，羊草80%，石粉0.7%，磷酸氢钙0.8%，食盐0.5%，添加剂1%；日粮的营养水平为粗蛋白质9.25%，粗脂肪3.38%，中性洗涤纤维47.21%，代谢能14.13 MJ·kg-1。青蒿素购买自上海泰鑫精细化工公司，采用萃取法制成。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

采用4×4拉丁方试验设计，整个试验分4期，每期预试期15 d，正试期10 d。预试期内动物自由采食，测定每天的采食量；在正试期内，根据预试期测定的采食量，以调节到维持饲养水平的1.2倍。在基础日粮中添加3个水平的青蒿素，其中A为对照组，不添加青蒿素；B组添加0.2%的青蒿素；C添加0.4%的青蒿素，D组添加0.6%的青蒿素。

1.2.2 样品的采集

在正试期间，在每一期的正试期的第3天开始采集瘤胃液，在晨饲前通过瘤胃瘘管，利用自制真空负压装置，从4只山羊瘤胃内分别采取瘤胃液各250 mL，经过4层纱布过滤，滤液装于事先通有CO2的灭菌生理盐水瓶中，混合均匀，39℃水浴保温。在饲喂前（0 h），饲喂后2、4、6、8、10和12 h分别采集瘤胃液30 mL，连续采集3 d，每次取样15～20 mL，采样后立即测定pH和原虫计数，然后将其余样品置于-20℃冷冻保存。

1.2.3 吞噬试验

参照文献[8]的方法进行。

1.2.3.1 无菌瘤胃液制备

对每期每只试验羊采集瘤胃食糜，离心（29000×g，20 min），收集上清瘤胃液并分别编号，4℃保存，一周内使用。

1.2.3.2 荧光标记瘤胃细菌的制备

1）采集瘤胃液，过2 μm 滤布，滤液离心（22 000×g，15min），收集沉淀，用灭菌生理盐水清洗和离心各两遍，然后悬浸于灭菌生理盐水中；2）加1.5～2 mL三氯三嗪基氨基荧光素（5- ([4,6-Dichlorotriazin-2-yl]amino) fluorescein hydrochloride，DTAF）染料进行染色，60℃水浴2 h；3）离心（22000×g，15 min），将上层DTAF 溶液倒出，再用灭菌生理盐水洗涤和离心各3遍；之后悬浸于与取样同体积的灭菌生理盐水中，-20℃保存，每期试验采样期内使用；4）用时解冻并离心（22000×g，15 min）后，分别用对应编号的无菌瘤胃液悬浸制成2倍浓度的荧光标记细菌（FLB）悬液。

1.2.3.3 操作步骤

1）采集瘤胃液，80目滤布过滤瘤胃液；2）滤液离心（150×g，10 min），并用无菌生理盐水洗涤原虫2次，用样品一半体积相应编号的无菌瘤胃液悬浸；3）将样品置于培养瓶中，设置尽量与瘤胃内一样的条件（39℃水浴、厌氧、50 r/min摇床）恢复培养30 min；4）吞噬实验：加等体积相应编号的2倍浓缩的FLB开始试验。在摄食后2、5、10、15、20、25、30、35、40和50 min用微型吸管分别吸取少量液体滴在载玻片上，加等量的甲醛固定，盖盖玻片马上镜检；5）先在普通显微镜下（100～400×）观察原虫形态，然后在1000×油镜下转置荧光背景对原虫体内的FLB 计数，观察原虫的总个体为6个，取平均值，每个时间点另外设3个平行对照组，再取平均值。

1.2.4 测定指标与方法

1.2.4.1 pH测定

用便携式pH 计（pHS-3C，上海雷磁试验设备厂）于采样后立即测定。

1.2.4.2 氨态氮（NH3-N）浓度的测定

采用酚-次氯酸钠比色法进行测定[9]。瘤胃液经1000 r/min离心5 min，取上清测定。A试剂（苯酚试剂）：称取苯酚9.975 g，亚硝基铁氰化钾50.65 mg，溶于H2O中，定容至1000 mL，放于棕色瓶中；B试剂（次氯酸钠试剂）：称取NaOH 5 g，溶于水中，待其冷却后加入20 mL次氯酸钠，混匀，定容至1000 mL。取瘤胃液4000 g离心10 min，取其50 μL上清液于10 mL试管中，依次加入A试剂和B试剂各3 mL，混合均匀，于60℃水浴10 min，冷水冷却，在紫外分光光度计546 nm比色，同时，用NH4Cl标准液重复上述步骤，做出标准曲线。

1.2.4.3 挥发性脂肪酸（VFA）浓度测定

用日本岛津GC-9A气相色谱仪按内标法进行测定[10]。瘤胃液处理：瘤胃液经10000×g离心10 min后取上清液1 mL加0.2 mL 20%含60 mmol·L-1巴豆酸的偏磷酸，混匀后高速离心取上清液0.4 μL进样分析。测定条件：毛细管柱CP-WAX（长30 m，内径0.53 mm，膜厚1 μm）；气化室温度200℃，FID检测器温度200℃；柱温采用程序升温法，初温100℃，末温150℃，升温速率3℃·min-1，灵敏度为101，衰减为25，以巴豆酸为内标物。

1.2.4.4 微生物蛋白（MCP）的测定

根据文献[11-12]的方法，取分离微生物样品经22000×g，离心10 min，弃上清液加入5 mL 10%三氯乙酸（TCA），混匀后置室温30 min，离心（6000×g，10 min），弃上清液再加入5 mL 5%NaOH混匀溶解后，离心（6000×g，10 min），取上清液用756型紫外光分光度计测定OD280nm和OD260nm值。

计算公式：MCP（mg·mL-1）=（1.45×OD280-0.740×OD260）×D。式中D为稀释倍数。

1.2.4.5 可溶性蛋白（SP）的测定

采用考马斯亮兰法（bradford法）取4 mL瘤胃液，于SKL快速混匀器振荡1 min后，经4℃ 20000×g离心（HitachiHimac SCR 20BC）20 min后，取上清液3 mL加入终浓度为0.15 mol·L-1高氯酸，静置20 min，再经4℃ 20000×g离心20 min，取沉淀用3 mL 2 mol·L-1NaOH水解，用考马斯亮蓝法测可溶性蛋白[13]。

1.2.4.6 瘤胃液肽含量的测定

根据Chen等[8,14]改进的方法将瘤胃液样品解冻、混匀，取出1 mL于10 mL试管中，加入3 mL10% TCA，混匀后静置15 min，3500 r/min 离心15 min，取上清液1 mL，加双缩脲试剂5 mL，充分混匀，室温静置30 min，540 nm测定吸光度值。

1.2.4.7 原虫计数

用细滴管取少量新鲜瘤胃液均匀地涂在血球计数板上，以MFS染液（NaCl 8 g，甲基绿0.6 g，福尔马林溶液100 mL，定容至1000 mL）染色，将血球计数板放在普通显微镜的光镜下计数（100×，400×）。很据不同属的原虫形态特征进行分类计数。计算公式：原虫数个/mL= N/4×D×16×10×1000 = N×D×4×104。中，N：计数的4个中方格的总数；D：稀释倍数。

1.2.4.8 细菌计数

以结晶紫溶液染色和做倍比稀释，用计数板在油镜下计数（1000×）。计算公式：细菌数个/mL=N/S×D×16×10×1000=N/S×D×16×104。式中，N：计数方格的总数；S：计数方格数；D：稀释倍数。

1.2.4.9 细菌真蛋白和原虫真蛋白的测定方法

取瘤胃液加等体积生理盐水39℃水浴震荡（125 r/min）培养60 min，并辅以搅拌；再经4层纱布过滤，滤液离心（150×g，10 min），收集沉淀为原虫，用生理盐水洗涤两次后用生理盐水悬浮，-20℃贮存待测。收集离心后上清液，再经过冷冻高速离心（22000×g，15 min），收集沉淀为细菌。将离心收集的细菌和原虫分开制成冻干样品，然后用全量凯氏定氮法测定气真蛋白含量。

1.2.5 统计分析

试验结果以平均数±标准误表示，基础数据采用Excel软件处理，试验结果的统计采用SPSS 13.0统计软件对数据分4个处理，4头动物进行4期有重复测定的方差分析，若处理间差异显著，再采用Duncan’s法分别在0.05和0.01水平进行差异显著性多重比较。

2 结果

2.1 不同添加水平的青蒿素对瘤胃液pH的影响

不同添加水平的青蒿素对瘤胃液pH的影响见表1。由表1可见，A、B、C、D 4组pH值的变化范围分别是6.85～7.16、6.92～7.13、6.87～7.13和6.91～7.14。各试验组与对照组的动态变化规律相似，采食2 h后各组的pH值都下降，除A组在4 h继续有小幅下降，其余各组缓慢回升，各组在4 h后都呈上升趋势，到12 h时基本都与饲喂前的水平相近。且在每个时间点各组之间差异都不显著（P>0.05）。从pH的均值来看，A、B、C、D的均值分别为6.93、6.99、6.99和7.00，添加青蒿素组与对照组相比具有提高瘤胃pH的趋势，但各组之间差异都不显著（P>0.05）。

2.2 不同添加水平青蒿素对瘤胃液NH3-N浓度的影响

不同添加水平青蒿素对瘤胃液NH3-N浓度的影响见表2。由表2可见，A、B、C、D组NH3-N浓度的变化范围为10.27～14.64、10.10～13.63、8.65～13.39和9.66～13.26 mg·100 mL-1。从NH3-N浓度的平均值来看，各组间差异都不显著（P>0.05），但各试验组的NH3-N浓度都低于对照组，B、C、D组分别比对照组下降了3.4%、11%和7%。平均值Average 11.67±0.66 11.27±0.59 10.41±0.72 10.90±0.59从不同时间NH3-N浓度的变化图1可以看出，各试验组与对照组的变化趋势大体一致。A、B、C、D组NH3-N浓度均在采食2 h时达到最高，然后呈下降回升波动的趋势，在12 h时又有所回升。其中，6 h时后C组极显著低于A组和B组（P<0.01），D组显著低于B组（P<0.05）；在8 h时C组和D组显著低于A组（P<0.05）。

2.3 不同添加水平青蒿素对瘤胃液挥发性脂肪酸产量及乙酸/丙酸的影响

不同添加水平青蒿素对瘤胃液挥发性脂肪酸产量百分含量及乙酸/丙酸的影响见表3。试验组乙酸比例的平均值与对照组相比，随着青蒿素的增加，乙酸比例呈下降的趋势，B、C两组显著低于对照组（P<0.05）；从丙酸比例的平均值来看，B组显著高于对照组（P<0.05），C、D组高于对照组，且差异极显著（P<0.01）。试验组的丁酸比例，C、D组显著低于A、B组（P<0.05）。青蒿素对乙酸/丙酸比值影响从乙酸/丙酸的平均值来看，试验组都低于对照组，其中B组显著低于A组，C、D组极显著低于A组（P<0.01）。

2.4 不同添加水平青蒿素对瘤胃液可溶蛋白浓度和微生物蛋白的影响

不同添加水平青蒿素对瘤胃液可溶蛋白浓度、微生物蛋白的影响见表4。由表4可知，添加青蒿素可降低瘤胃培养液中可溶蛋白量，且C、D组与A、B组之间差异极显著（P<0.01），B与A组差异显著（P<0.05）。B、C、D组比对照组A组分别提高14.5%、23.4%和27.1%。由表5可见，原虫蛋白含量均随青蒿素添加量的增加而减少，其中B组比A组减少了0.08 mg·mL-1，差异显著（P<0.05）。C、D两组比A组都减少了0.19 mg·mL-1、差异极显著（P<0.01）。另外还可见，添加青蒿素可提高瘤胃中的细菌蛋白，对照组的细菌蛋白为0.56 mg·mL-1，各试验组与对照组比较，分别提高了细菌蛋白产量，其中B、C两组比对照组都提高了25%，差异显著（P<0.05）。D组比对照组A组提高34%，差异极显著（P<0.01）。对照组的MCP为1.34 mg·mL-1，低于B组。

2.5 青蒿素对山羊瘤胃主要种属原虫结构的影响

青蒿素对山羊瘤胃主要种属原虫结构的影响见表5，随着青蒿素添加量的增加，细菌总数增加，而原虫总数逐渐减少，其中内毛虫和双毛虫的数量降低，而等毛虫的数量增加。B组原虫数显著低于A组（P<0.05），C、D两组极显著低于A组（P<0.01）。C、D两组的内毛虫数量显著低于A组（P<0.05），而双毛虫与等毛虫的比例显著高于A组（P<0.05），B组的内毛虫、双毛虫和等毛虫与其他各组相比差异均不显著（P>0.05）。从表2中可以见添加青蒿素组的内毛虫比例显著降低（P<0.05），使双毛虫和等毛虫比例显著提高（P<0.05）。

2.6 不同青蒿素添加量对山羊瘤胃原虫的细菌吞噬速率和微生物蛋白循环影响

由表6可知标记10 min以后，原虫的吞噬速率开始降低，此时原虫已经开始消化细菌，随着时间的延长，瘤胃原虫对细菌的吞噬速率会与消化速率保持平衡，甚至吞噬速率会低于消化速率，通过数据处理与分析，综合考虑后将原虫的吞噬速率计算时间定到25 min，以减少原虫消化带来的误差。如表6所示在25 min内吞噬量逐渐上升，尚未达到下滑期，此时在该时间段之内吞噬试验结果的可靠性较高。

对原虫的吞噬量与时间进行25 min内线形回归分析，两组回归方程分别为：

A组：Y=2.05+5.301X（R=0.99）；B组：Y=0.5+5.224X（R=0.99）；C组：Y=-1.716+5.112X（R=0.99）；D组：Y= 0.7+4.624X（R=0.99）。式中：Y为原虫吞噬细胞量，X为吞噬时间。

由回归直线方程可计算原虫的吞噬速率A组、B组、C组、D组分别为：320.11、313.94、305.00、278.14cells/（cell·h）。

2.7 不同青蒿素添加量对原虫吞噬细菌后瘤胃微生态的影响

瘤胃液中原虫的密度见表7，青蒿素添加量为0.6%时，D组最低，而对照组最高；在本试验中，各组原虫密度随着青蒿素添加量的增加而减少，瘤胃液中细菌的密度在青蒿素添加量为0.6%时，D组最高，在不添加时，对照组A组密度最小。A、B、C、D四组吞噬速率分别为：320.11、313.94、305.00和278.14 cells/（cell·h）。当添加0.2%的青蒿素时，差异不显著（P>0.05），当添加0.4%和0.6%的青蒿素时，与对照组差异显著（P<0.05）。根据原虫的密度计算原虫对细菌的吞噬量结果（见表7），以D组最低，为386.84×105cells/（cell·h），A组最高为752.26×105cells/（cell·h）。结合细菌的密度再计算由于原虫吞噬造成的细菌蛋白循环的周转时间和周转率，结果表明：以D组周转率最低为1.1%（每小时约有1.1%的细菌被原虫吞噬），周转时间最长为96.03 h（即原虫吞噬经过96.03 h细菌可周转更新一轮）；以A组周转率最高为2.6%，周转时间最短为39.08 h。

不同青蒿素添加量对原虫吞噬细菌引起瘤胃内MCP微循环发生变化。瘤胃原虫的密度以A组最高，D组最低；A、B、C、D四组吞噬速率分别为：320.11、313.94、305.00和278.14 cells/（cell·h）。根据原虫的密度计算原虫对细菌的吞噬量分别为：752.26×105、586.13×105、442.26×105和386.84×105cells/（mL·h）。

由此可以计算得出A组、B组、C组、D组吞噬N速率分别为：1.729、1.695、1.647和1.502 pg N/（cell·h），即是原虫在瘤胃内循环中对细菌N的吞噬速率。每天每头羊因原虫的吞噬细菌N量估计为：A组：82.97 mg N/（d·头）；B组：81.37 mg N/（d·头）；C组：79.06 mg N/（d·头）；D组：72.09 mg N/（d·头）。如换算为微生物蛋白后，A组、B组、C组、D组微生物蛋白内循环量分别为：518.58、508.58、494.11和450.59 mg Pr/（d·头）。

3 讨论

3.1 青蒿素对瘤胃发酵和内环境指标的影响

评价瘤胃发酵效率一般采用瘤胃液中酸度、氨氮浓度、瘤胃内挥发性脂肪酸产量和微生物蛋白产量等内环境指标。pH是一项反映瘤胃发酵水平的综合指标，是维持瘤胃微生物正常生长繁殖的重要条件。它受日粮性质、唾液分泌及瘤胃内酸、碱性物质排出、吸收的影响[15-16]。pH的正常变动范围为6.5～7.5，当pH低于下限时，瘤胃内的微生物活力降低，数量减少或完全被酸性环境杀死，酸度升高将增加瘤胃酸中毒的机会，对机体生理机能有很大的影响[17]。一般情况下，采食后瘤胃pH下降，而后逐渐升高，瘤胃pH呈波动和变化，pH的波动曲线反映集聚的有机酸和产生唾液的变化。一般在饲喂后2～6 h达到最低值。本试验中，A、B、C、D4组瘤胃液pH的日变化范围分别是6.85～7.16、6.92～7.13、6.87～7.13和6.91～7.14，pH均在正常的变化范围5.5～7.5内，说明添加青蒿素能稳定瘤胃的内环境。青蒿素对原虫起直接抑制作用，而不是通过改变瘤胃内pH来实现的。瘤胃液NH3-N水平反映了饲粮中蛋白质含量、饲粮的蛋白质在瘤胃内降解的特性、能量供应和微生物蛋白质的合成状况。

瘤胃NH3-N水平受诸多因素影响，如氮进食量，饲料蛋白降解率，瘤胃微生物合成速度，瘤胃对氨的吸收和内源含氮物质的周转和能量水平以及蠕虫感染等因素的影响。氨是瘤胃内饲料真蛋白质和非蛋白氮分解的中间代谢产物，同时也是瘤胃微生物合成微生物蛋白的氮源，微生物生长需要一个合适的水平，其最佳NH3-N浓度为6.3～27.5 mg·100 mL-1[18-19]，本试验4组NH3-N的平均浓度在8.65～14.164 mg·100mL-1，在正常范围内。本试验各组的NH3-N浓度均在饲喂2 h后达到最高，之后开始下降，在下一次饲喂之前又开始回升，符合实际情况。从NH3-N浓度的平均值来看，青蒿素添加组的值都低于对照组，说明青蒿素能够降低瘤胃液中的NH3-N浓度，从而减少了蛋白以NH3-N形式的损失，此结果与体外试验结果相符合[4]。

瘤胃内挥发性脂肪酸（VFA）是反刍动物生长发育的主要能量来源之一，其提供的能量占反刍动物所需能量的70%～80%左右[20]，瘤胃VFA的产量和组成比例是评述瘤胃发酵方式和能量转化的直接指标。瘤胃发酵类型即乙酸/丙酸比也明显地影响着能量的利用率和能量储存部位。乙酸是反刍动物脂肪合成的主要前体，丙酸则是反刍动物重要的葡萄糖前体，因此丙酸型发酵能为机体提供更多的能量，丙酸发酵可降低甲烷的生成从而降低因嗳气引起的能量消耗，有利于肉用家畜增重。本试验中添加一定量的青蒿素能使瘤胃产生相对较多的VFA，这说明该水平下瘤胃微生物活性较强，与对照组相比，更有利于瘤胃发酵。本试验结果表明，不同处理组的山羊瘤胃TVFA浓度随时间点的不同而呈现一定的规律性变化，即采食后TVFA浓度在2 h内迅速上升，各组在2 h达到最大值，随后呈波动状，而后迅速下降。从各组的平均值来看，各试验组的乙酸、丙酸及TVFA浓度都比对照组有所提高，添加量为0.6%的D组最高，此试验结果表明青蒿素能够增加挥发性脂肪酸的浓度，使发酵产生了更多满足动物需要的能量。试验组的乙丙比都低于对照组，且随着青蒿素的增加，乙丙比呈下降趋势，其中添加量为0.2%组显著低于对照组，添加量为0.4%和0.6%的组与对照组差异极显著。本研究证明，青蒿素能够改善瘤胃发酵类型，可大幅度降低瘤胃内原虫数量，而原虫数量减少时瘤胃发酵类型主要为高丙酸发酵类型。这种作用可能是由于青蒿素抑制纤毛虫时瘤胃内产丙酸菌占优势，如产生琥珀酸的细菌数量增多，琥珀酸经三羧酸循环而产生丙酸的缘故。乙/丙比值的下降，降低了细菌利用H2和CO2产生甲烷的能力，大大减少了饲料转化过程中能量的浪费，同时减少了大气中甲烷的含量，对生态环境的改善具有重要的意义。

3.2 青蒿素对瘤胃微生物种群结构和微生物蛋白产量的影响

反刍动物瘤胃内栖居有大量的微生物，其中主要包括厌气性细菌、原虫和厌气性真菌三大类。原虫可捕食瘤胃细菌作为自身生长底物，在原虫大量存在时，细菌密度降低，细菌蛋白减少。目前，国内外许多学者都致力于用植物次生代谢产物来控制瘤胃原虫的数量，从而增加细菌数量和细菌蛋白。Lu等研究指出，添加0.2%和0.4% 苜蓿皂素时，其瘤胃原虫数量分别降低34%和66%[21]；Navas等研究发现，豆科皂苷物质可使瘤胃原虫数量降低，但不会彻底去除原虫。并且在瘤胃原虫当中，纤毛虫对于豆科皂苷物质最为敏感[22-23]。本试验添加青蒿素后，山羊瘤胃中原虫数量减少，青蒿素对原虫具有抑杀作用。试验各组原虫数均比对照组小，B组原虫数量显著低于A组（P<0.05），其中C、D组极显著低于A组（P<0.01），效果最为明显。对原虫的抑杀效果最好。本试验也发现添加青蒿素后瘤胃原虫的各种属比例也发生了一定的变化，总的表现为内毛虫比例下降，双毛虫和等毛虫的比例上升，与体外研究的结果也一致，可能与青蒿素对原虫的抑杀具有一定种属选择性有关。原虫不能利用氮源合成自身所需要的氨基酸，其生长必需靠吞噬细菌获得氨基酸。原虫通过自溶作用进行代谢，而这种自溶作用产生的NH3不能被再次利用，这样造成了氮的无效循环。这种无效循环使微生物蛋白质产量下降，驱除原虫以使MCP的产量提高，增加了过瘤胃蛋白质的数量。本试验结果表明，添加青蒿素可以降低原虫蛋白产量，提高细菌蛋白产量及提高微生物蛋白总产量。添加0.4%和0.6%时，与对照组差异极显著；添加0.2%时与对照组差异极显著，细菌蛋白最高，微生物总蛋白最高。添加青蒿素使MCP产量增加的可能是因为瘤胃原虫与细菌之间存在拮抗作用，添加青蒿素可以降低原虫的数量，减弱原虫对细菌的吞噬作用，由此使得细菌数增加，微生物蛋白产量提高。

3.3 青蒿素对原虫吞噬细菌后瘤胃微生态和微生物氮微循环的影响

瘤胃内原虫与细菌之间存在着吞噬与被吞噬的关系，因为原虫不能利用氨，只能靠吞噬细菌来获得氮源，原虫的存在增加了微生物氮的无效循环。本研究中添加青蒿素后，试验组比对照组的原虫密度降低，细菌密度增高，最终引起了原虫对细菌的吞噬速率的降低，吞噬量的减少。也因此带来了低的周转率和长的周转时间。其中D组的周转率最低，周转时间最长。分别为：1.1%和95.83 h，即在此青蒿素添加量条件下需96.03 h才可使细菌因被原虫吞噬而周转一次。估算菌体蛋白循环量结果表明该组循环量为450.59 mg/（d·头）。相比而言，A组由于没有添加青蒿素，原虫活力较高，密度较高，并且吞噬速率最高，因此该组吞噬量最高，其细菌周转率最高为2.6%，被更新一次仅39.08 h。对该组菌体蛋白循环的估算为518.08 mg/（d·头），因此D添加组能够较好的减少MCP的循环量，在添加青蒿素的条件下原虫的吞噬更容易影响MCP产量和宿主蛋白质营养。本研究中徐淮山羊瘤胃原虫吞噬细菌速率的测定结果在通常认为的瘤胃原虫吞噬速率102～104cells/（cell·h）范围内，与王梦芝等研究的瘤胃原虫的吞噬速率接近[24]。本试验结果表明，添加青蒿素后使原虫的活力降低，从而使它对细菌的吞噬量减少。随着青蒿素添加水平提高，平均原虫数呈下降趋势，说明青蒿素具有杀原虫作用和抑制原虫活性的作用；随着青蒿素的不断增加，原虫吞噬细菌的速率和吞噬细菌的量也不断下降，印证了青蒿素具有能够降低原虫活性、抑杀原虫的作用。本研究中确定添加0.6%青蒿素水平可显著抑制原虫对细菌的吞噬作用，从而使山羊瘤胃原虫吞噬速率和微生物氮循环量减少。其主要机理可能是青蒿素通过抑制原虫的活性使它对细菌的吞噬量减少。但青蒿素对于原虫的抑制机理还不清楚；有关青蒿素对饲料蛋白质利用效率和对机体氮代谢的影响有待今后继续深入研究。

4 结论

4.1 青蒿素对山羊瘤胃内微生态环境指标有一定影响。对pH无显著影响，而有降低瘤胃内NH3-N浓度的趋势；同时它能够增加总挥发性脂肪酸的浓度，显著降低乙酸/丙酸的比例而改善瘤胃发酵模式。

4.2 青蒿素对山羊瘤胃中细菌总数、原虫总数及其不同种属的百分比例有显著调控作用。添加青蒿素不仅会使瘤胃细菌总数增加，使原虫总数降低，而且使原虫种属比例改变，即内毛虫比例显著降低，使双毛虫和等毛虫比例显著提高。

4.3 青蒿素会抑制瘤胃内原虫对细菌的吞噬作用。青蒿素降低了原虫对细菌的吞噬速率和微生物氮循环量，以日粮中添加0.6%青蒿素的效果最显著。同时，添加0.6%青蒿素可显著降低山羊瘤胃内菌体蛋白的微循环，从而提高饲料中蛋白质在反刍动物瘤胃内的利用效率。

摘编自《中国农业科学》2014年第24期：4904～4914页，图、表、参考文献已省略。