国内外青蒿素生产过程差异性比较

贾成友，于金英，张传辉，王云红，禹奇男，杨荣平

（1.成都中医药大学药学院，成都 611137；2.重庆市中药研究院中药制剂研究所，重庆 400065）

国内外青蒿素生产过程差异性比较

贾成友1,2，于金英1,2，张传辉1,2，王云红2，禹奇男1,2，杨荣平1,2

（1.成都中医药大学药学院，成都 611137；2.重庆市中药研究院中药制剂研究所，重庆 400065）

青蒿（Artemisia apiacea）系菊科（Compositae）植物黄花蒿（Artemisia annua L.）的干燥地上部分，具有清热解暑、除蒸截疟之功效，主治暑热、暑湿、湿温、阴虚发热、疟疾和黄疸等症[1]。现代药理研究表明，青蒿在抗疟、抗肿瘤、抗菌杀虫、抑制免疫功能亢进、抗心律失常、抗孕、抗单纯疱疹病毒等方面作用明显，同时可用于红斑狼疮、心律失常的治疗以及降低机体本身对类风湿性关节炎的过度免疫[2-4]。

青蒿素是从青蒿中提取分离出的含过氧桥基的新型倍半萜内酯，分子式C15H22O5，分子量282.34，具有抗疟、抗菌、解热、增强免疫等药理活性，尤为适宜于恶性疟疾、脑型疟疾的治疗，是世界卫生组织推荐治疗疟疾的首选药物[5,6]。我国学者许杏祥等在1986年经化学反应首次合成了青蒿素，诠释了全合成途径和关键反应参数[7]，此后，国外也相继开展了有关青蒿素全合成途径和方法的研究。合成所常用的原料主要有香茅醛、异胡薄荷醇、异柠檬烯、薄荷酮、β-蒎烯和环己烯酮等[8]。青蒿素的化学全合成研究虽取得了一定进展，但由于合成路线繁琐、难度大，工艺复杂、成本高，不适合工业化生产[9]等种种因素，青蒿素化学合成在工业生产中难以普遍开展，其商业价值也未得以体现。因此，国内外研究者开始转向青蒿素合成生物学及代谢工程研究，以期在微生物体内构建青蒿素生物合成途径，并对青蒿中原有的青蒿素生物合成途径进行遗传改良，从而增加青蒿素产量[10]。本研究通过比较国内外青蒿素生产过程的差异，分析国内在青蒿素生产研究方面存在的问题，并提出了解决此类问题的方法和建议，为青蒿素进一步研究提供参考依据。

1 青蒿素获取途径

青蒿素主要来源于以下3个方面：直接从青蒿药材中提取、单体物质经过多步化学反应合成或通过组织培养和转基因克隆法生物合成。在我国，青蒿素主要依靠从青蒿中直接提取，而国外则多通过化学合成和生物合成得到青蒿素或增加其产量。

2 青蒿素研究领域

国内，医药研究者充分发扬中国在青蒿素科学研究上的传统优势，研究领域多集中在快速高效提取、分离纯化和检测青蒿素及青蒿素转基因青蒿植株培育、青蒿素合成生物学和代谢工程方面；国外，青蒿素研究领域不仅囊括青蒿素转基因青蒿植株培育、青蒿素合成生物学和代谢工程，而且开始转向以异源生物作为反应器来高效生产青蒿素，并已经成功生物合成了青蒿素。此外，国内外医药工作者在青蒿素研究的基础上合成开发出的青蒿琥酯（artesunate）、蒿甲醚（artemether）、蒿乙醚（arteether）和二氢青蒿素（dihydroartemisinin）等，血中溶解度好，生物利用度高，对抗氯喹性疟疾及致命性脑型疟有很好的治疗效果[11]，有效地避免或延缓了恶性疟原虫对青蒿素类药物抗药性情况的发生。

3 国内外青蒿素生产过程差异性比较

3.1 国内青蒿素生产过程

3.1.1 直接从青蒿中提取青蒿素

青蒿广泛分布于我国南北各地，但是野生生长和集中种植地域狭窄，不同产地青蒿中青蒿素含量差异较大（0.12%～1.30%）[12]，以重庆酉阳所产青蒿素含量居多。

3.1.1.1 提取方法

目前，我国青蒿素主要由青蒿饮片经处理后提取、纯化而来。常用的青蒿素提取方法有传统溶剂法及近些年发展起来的新型提取工艺和联用技术[13]。传统溶剂法包括室温提取、冷浸提取、索氏提取、回流提取；新型提取工艺技术包括超声提取技术、超临界CO2萃取技术、微波辅助萃取技术和快速溶剂萃取技术等。

近年来，我国医药工作者在传统溶剂提取法的基础上，结合青蒿药材和青蒿素物化特点，采用新型提取工艺和联用技术对青蒿素高效提取开展了一系列研究。张颖[14]以青蒿素提取量为考察指标，采用有机溶剂提取法，在单因素试验基础上，进行3因素3水平正交试验，得出青蒿素最佳提取工艺条件，在该条件下青蒿素提取量达5.27 mg‧g-1。卢婉怡[15]利用响应面试验设计法考察纤维素酶辅助提取过程中时间、加酶量、温度对青蒿素提取率的影响，并对提取工艺条件进行优化，结果优化条件下青蒿素提取率较未使用酶辅助提取工艺提高了1.89倍。另有研究者通过超临界CO2萃取法对青蒿中青蒿素进行提取，同时考察萃取压力、温度以及时间对青蒿素收率的影响，优化了提取工艺，使得青蒿素提取效率大大提高[16]。研究还发现，采用微波辅助提取法、快速溶剂萃取法提取青蒿素，与传统溶剂提取结果相比较后发现，二者提取效率显著高于传统溶剂提取法[17-20]。此外，徐朝辉等[13]将超声提取-膜过滤-超临界萃取联用技术用于青蒿素的提取，大大提高了青蒿素的收率（0.48%）和纯度（92%），减少操作工序及污染，提高效益。邓启华等[21]将连续逆流技术与超声波技术结合，应用到黄花蒿中青蒿素的提取试验中，不仅加快了提取速率，同时使青蒿素的提取率高达89%。各提取方法原理和特点如表1所示。

3.1.1.2 纯化手段

目前，文献报道有关青蒿素分离纯化工艺的研究方法主要有大孔树脂吸附法和硅胶柱层析法等。庞斐等[26]采用超临界流体色谱技术对青蒿萃取液中青蒿素进行提纯，使得青蒿素的含量达到74.83%。韦国锋等[27]采用ADS-17大孔吸附树脂提取青蒿素，使得青蒿素提取率高达75%，青蒿素含量大于99%。胡淼等[28]利用硅胶柱层析纯化超临界CO2提取所得青蒿素膏体，使得青蒿素含量可由原来的15%提高到70%以上，回收率达90%。周凌云[29]采用硅胶柱层析法纯化青蒿素，利用不同比例石油醚与乙酸乙酯进行梯度洗脱，90%乙醇结晶，考察填料、洗脱剂及层析次数对纯化的影响，结果青蒿素含量高达 97.5%。由此可见，青蒿素可以通过大孔吸附树脂和硅胶柱层析达到分离纯化的目的。而南加州大学Chandrakant R等人[30]采用槲皮素反溶剂结晶法纯化青蒿素，同样取得良好成效，提示后期青蒿素纯化研究不宜仅仅局限于一个方面，应关注国际研究形式，多方位多靶点研究青蒿素纯化方法，可以开发一种专门针对青蒿素富集纯化的青蒿素接枝交联壳聚糖树脂，用于青蒿素的纯化。

综上，青蒿素的获取已形成一个从提取到分离纯化的完整流程。事实上，青蒿素提取、分离纯化中仍存在有效成分提取不完全、溶剂残留等问题，亟待进一步地研究与改善。根据表1中内容，对比各提取方法可知，寻求一种简单方便，提取率高，溶剂残留少，成本低，适合工业化生产的提取方法、纯化工艺显得尤为重要。

3.1.2 转基因植株培育

在生物合成青蒿素研究领域，我国主要侧重于青蒿植株的组织培养和转基因植物研究，并取得了显著成效。叶和春等首次将重组法呢基焦磷酸合成酶基因（FPS）导入青蒿，增加了FPS基因的拷贝数目，由此获得青蒿素含量比对照高约4倍的转基因青蒿发根（0.2%～0.3%）[31]及比对照高约3倍的转基因青蒿植株（0.8%～1.0%）[32,33]。曾庆平[34]等将反义鲨烯合酶基因（asSS）导入青蒿，阻断了竞争青蒿素生物合成的类固醇分支途径，获得的青蒿植株类固醇含量比对照植株降低近一半，同时，植株青蒿素含量比对照植株提高近3倍。Chen JL等[35]利用β-石竹烯合酶cDNA反义片段抑制青蒿的倍半萜合成支路，减少了β-石竹烯对紫穗槐-4,11- 二烯的竞争抑制，使得青蒿素含量提高50%。另有研究发现，青蒿素主要在青蒿叶片腺状分泌毛状体中合成[36]，细胞分裂素可刺激叶片生长，故推断提高青蒿中的细胞分裂素水平有可能促进青蒿素的合成。Geng S 等[37]将异戊烯基转移酶基因（ipt）导入青蒿，使细胞分裂素水平提高近3倍，青蒿素含量增加了30%-70%。诸如此类的研究成果直接或间接应用于青蒿素的实际生产，使得青蒿素类药物产量大增，为降低疟疾发病率和死亡率，解决青蒿素原料药供不应求，市场价格飙升[10]的问题带来了新契机。

3.2 国外青蒿素生产过程

合成生物学作为一项新兴领域，潜在地改善着全球健康，依靠其合成的新药物，可再生化学品或清洁能源正慢慢走进人们的生活[38,39]。国外，医药研究者在微生物中合成青蒿素前体后选择改用化学方法半合成青蒿素，并已启动产业化进程。已有研究证实，青蒿素生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径。该途径有酶和能产生青蒿素前体物质的异源生物的参与，同时受到基因调控的影响。

参与类异戊二烯代谢途径的关键酶主要有3-羟基-3- 甲基戊二酰CoA还原酶（HMGR）[40,41]，法呢基焦磷酸合酶（FPPS）[40]，紫穗槐-4,11- 二烯合酶（ADS）[42]，紫穗槐-4,11- 二烯P450单加氧酶[43]等。中间体主要有青蒿酸[7]，青蒿素B[44]，青蒿烯[45]，二氢青蒿素[46]四种。鉴于关键酶和中间体研究开始的比较早，研究成果较成熟，文献、综述中多有论述，本文不做详细介绍，仅从利用异源生物为载体通过基因调控体内合成青蒿素方面加以阐释。

常用的异源生物包括大肠杆菌、沙门氏杆菌、酵母和烟草等。大肠杆菌生长快速，遗传性好，与沙门氏杆菌在形态上和生理上都极其相似，并可以执行一个基于内生大肠杆菌transcription-translation（TX-TL）游离表达系统产生等效大量蛋白质T7的高效系统[47]。酵母菌与植物亲缘关系比较接近，发酵时间短，产物量高，且可以简化提取和纯化过程。烟草叶片生物信息量大，具有精细的调控系统，可以通过光合作用获得代谢前体物质，且遗传转化研究较多，种种特点使得大肠杆菌、沙门氏杆菌、酵母、烟草等被用作分子代谢物异源表达的宿主，用以青蒿素的合成。

早在2001年，Wallaart[40]等已将ADS基因导入烟草，并成功获得了可以产生0.2～1.7 ng‧g-1鲜重的紫穗槐-4,11- 二烯转基因烟草，发现 ADS基因在转基因植物中能表达出有活性的蛋白，为之后通过青蒿转基因植株提高青蒿素产量的研究奠定基础。Newman等[48]通过对酵母菌发酵工艺进行优化，利用紫穗槐-4,11- 二烯工程菌，采用两相发酵法，使紫穗槐-4,11- 二烯的产量达到0.48 g‧L-1。Kajiwara等[49]将IPP异构酶编码基因（idi）在细菌中过量表达，结果提高了类异戊二烯的积累量。另有文献[50]报道称，通过对半域突变等位基因upc2-1 过量地表达，可以在一定程度上提高了紫穗槐-4,11- 二烯的产量，使紫穗槐-4,11- 二烯的产量达到153 mg‧L-1，与Martin等[51]利用工程大肠杆菌生产紫穗槐-4,11-二烯的产量相比较提高近500倍。Starai等[52]通过调控沙门氏杆菌乙酰辅酶A合酶，发现乙酰基转移酶对乙酰辅酶A合成酶609位点的赖氨酸乙酰化，使乙酰辅酶A 合成酶失活，而辅酶II（NADP）依赖性Sir2蛋白催化乙酰辅酶A合成酶脱去乙酰基，从而使其恢复酶活性。Shiba课题组[53]以此为基础，将质粒载体将沙门氏杆菌乙酰辅酶A合成酶去乙酰基化位点基因L641P与ALD6基因转入紫穗槐-4,11- 二烯工程酵母中，结果紫穗槐-4,11-二烯的量提高了1.9 倍。Redding-Johanson 和Westfall 两个课题组[54,55]先后通过对代谢途径中的酶进行启动子修饰，进而提高了工程菌中紫穗槐-4,11- 二烯的产量，为进一步的合成提供了有力支持。不同的是，前者仅对甲羟戊酸激酶和磷酸甲羟戊酸激酶进行修饰表达，而后者对整条代谢途径过程中的酶基因都进行了启动子修饰。对比二者结果发现，对全部参与的酶都表达可以使青蒿酸、紫穗槐-4,11- 二烯产量大为增加，可见酶在生物合成中起到举足轻重的作用。控制、调控好酶的作用就为中间产物和青蒿素的生成奠定了基础。目前，科研领域已经有报道[56]，将酵母菌和烟草作为紫穗槐-4,11- 二烯、青蒿酸中间体人工制备系统的宿主细胞，可制备出青蒿素，虽然产量较低，但是意义重大，表明通过异源宿主细胞可以获得青蒿素。今后研究中，以此类中间体为合成前体，再通过广泛的半合成青蒿素的研究，青蒿素的产量将会无限接近工业化的水平，青蒿素类药物供需不平衡的偏态将被打破，为有效地降低青蒿素的价格，控制疟疾在贫困国家的肆虐起到应有的作用。

4 问题与展望

至今青蒿素类药物仍然是治疗恶性疟疾、脑型疟疾的首选药。鉴于青蒿素类药物需求量逐渐增加的态势，实现青蒿素高效、多产就显得尤为重要。国内外青蒿素生产过程存在差异，我国主要从青蒿中直接提取获得青蒿素，并结合转基因诱导提高青蒿中青蒿素含量；而国外则通过在微生物中合成青蒿素的前体后改用化学方法半合成青蒿素，或以大肠杆菌、酵母菌和烟草为宿主细胞，体内合成青蒿素。造成这种研究侧重点存在差异的原因有历史和现实双重因素。青蒿在中国有着悠久的种植和使用历史，人们更愿意以传统的思维和手段去研究、利用它，开发也只局限于青蒿转基因植物的培育方面，在生物合成方面虽有涉及但研究不够深入。国外研究者不受传统经验和研究方法的束缚，更倾向于向更深领域的开拓，这也促成了他们在生物合成青蒿素领域处于遥遥领先的地位。

青蒿素的研究开发是一段艰辛的路程，我们可以借鉴国外研究的最新成果，加快国内青蒿种植和青蒿素产业化建设，同时也应该形成自己的特色：研究过程中应着力加强青蒿素转基因青蒿植株的田间试验和评价，加强青蒿素合成反应的分子物质基础研究，以此建立青蒿及转基因青蒿中由中间体转变为青蒿素的外部条件，从而实现优质、高产等优转基因青蒿品种的普及和应用；此外，还应重点完善青蒿素高效提取方法，解决溶剂残留问题，优化青蒿素纯化工艺，建立青蒿素快速高效检测方法，为青蒿素工业化生产提供依据，造福数亿患者。

摘编自《世界科学技术—中医药现代化》2015年3期：734～739页，图、表、参考文献已省略。