IGHMBP2过表达促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移

王春丽，郝佳洁，吴李飞，潘蓓青，徐昕，蔡岩，王明荣，贾雪梅



IGHMBP2过表达促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移

王春丽1，郝佳洁2，吴李飞3，潘蓓青2，徐昕2，蔡岩2，王明荣2，贾雪梅1

1. 安徽医科大学组织胚胎学教研室，合肥 230032；2. 中国医学科学院北京协和医学院，肿瘤医院肿瘤研究所，分子肿瘤学国家重点实验室，北京 100021；3. 安徽医科大学安庆市立医院消化内科，安庆 246000

(Immunoglobulin mu binding protein 2)基因编码一种解旋酶，参与DNA的复制和修复，并且作为转录调节因子在基因转录中发挥重要作用。基因定位于11q13.2，该染色体区段在食管鳞癌中扩增频率较高。为了探讨基因在食管鳞癌中的扩增情况及其在食管鳞癌中的作用，文章对本实验室前期报道的59例食管鳞癌原发肿瘤array-CGH数据进行分析，结果显示基因扩增频率为28.9%(17/59)。进一步利用荧光原位杂交(FISH)和Western blot技术，发现食管鳞癌细胞系KYSE30、KYSE180、KYSE510和KYSE150中存在基因扩增/增益以及蛋白高表达。敲降IGHMBP2后，KYSE30和KYSE150细胞的侵袭迁移能力明显降低(<0.001)，侵袭迁移相关蛋白E-cadherin的表达水平升高；敲降后转染IGHMBP2质粒，回复其蛋白表达后，细胞的侵袭迁移能力又得以恢复(<0.01)。上述结果表明，IGHMBP2过表达可能通过降低E-cadherin的表达从而增强食管鳞癌细胞的侵袭迁移能力。

IGHMBP2；食管鳞癌；扩增；侵袭；迁移

食管鳞癌是人类常见的恶性肿瘤之一。尽管术前分期充分，可手术原发性食管鳞癌患者的术后5年生存率仍未超过40%[1]。近年来，手术方式和放化疗技术取得很大改进，但食管鳞癌仍然具有较差预后[2]。因此，研究食管鳞癌发生和转移的分子机制，将有助于了解肿瘤形成原因，为建立新的治疗方法提供可能。

基因扩增是恶性肿瘤常见的遗传学改变之一[3~5]，也是癌基因激活的机制之一[6]。扩增引起的DNA拷贝数增加可能通过上调凋亡抑制蛋白表达等机制，导致癌变细胞逃避凋亡，从而产生耐药[7,8]。因此基因扩增有可能作为肿瘤治疗的分子靶点[9]。

Ying等[10]利用比较基因组杂交鉴定出3q26-q27、8p22-p24、11q13及13q21-q31等染色体区段的扩增。位于11q13区段的和等癌基因的扩增可能在食管鳞癌中发挥重要作用，其中扩增与位于中上段食管肿瘤的低分化显著相关，而食管鳞癌中扩增及蛋白过表达可能与淋巴结转移相关[11,12]。Shi等[13]发现11q13.3染色体区段内基因在mRNA及其编码的蛋白ANO1水平均高表达，且mRNA水平和拷贝数增加相关，蛋白过表达与淋巴结转移和临床进展期相关。11q13.1-q13.4、3q24-q29等是最常见的拷贝数改变的区域，研究发现在食管鳞癌病人中长生存组和短生存组均检测到位于11q13.2的两个基因(和)的拷贝数改变[14,15]。因此推测11q13.2可能存在对食管鳞癌发生发展起重要作用的基因。

本文对59例食管鳞癌原发肿瘤比较基因组杂交微阵列(Array-CGH)数据进行了分析，并在8个食管鳞癌细胞系中检测了(Immunoglobulin mu binding protein 2)基因的扩增和表达情况，初步探讨了其在食管鳞癌细胞中的作用。

1 材料和方法

1.1 食管鳞癌细胞系

KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE180、KYSE410、KYSE450、KYSE510和Colo680N食管鳞癌细胞系由日本东京大学Shimada教授惠赠。细胞培养条件：含10%胎牛血清(康源生物)的RPMI 1640培养基(BIOROC)，在37℃含5%CO2的培养箱中培养。

1.2 荧光原位杂交(FISH)及结果评定标准

基因BAC探针(NONSC29F5)和11号染色体着丝粒探针(Centromere enumeration probe，CEP)11分别用Cyanine 3 (Cy3)-dUTP和Fluorescein (FITC)-dUTP通过随机引物法标记。

荧光原位杂交步骤及图像采集参照本实验室之前报道的方法[16]。

FISH结果评定标准为：计算细胞核内红色的荧光信号和绿色荧光信号的数目比值，若红色和绿色荧光信号的数目大于3而且比值大于或等于1.5视为阳性扩增；若红色和绿色荧光信号的数目等于3而且比值等于1视为增益；若红色和绿色荧光信号的数目等于2则视为未扩增。

1.3 Western blot

培养细胞至对数生长期时收获，用预冷PBS洗两次，加入适量PBS，用细胞刮刮取细胞收集于1.5 mL离心管中，1 000 r/min离心10 min后弃上清，加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清移至新的离心管中。蛋白定量后取50 µg蛋白样品，加入上样缓冲液，沸水浴中变性10 min，离心，经10% SDS-PAGE在80 V电泳30 min，然后100 V电泳2 h；采用半干式电转仪(12 V，2 h)将蛋白从分离胶转移至PVDF膜，5%牛奶封闭，分别加入一抗4℃孵育过夜，一抗分别为抗IGHMBP2(Proteintech)、E-cadherin(BD)、β-catenin (Cell signaling Technology)和GAPDH(Proteintech)。TBST洗3次，每次6 min，以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG(Applygen)为二抗常温孵育1 h，加入化学发光剂(Applygen)，在X片胶上显影。

1.4 siRNA转染

siRNA靶序列分别为5¢-GCUUUACUUCUGG­U­GAUAUTT-3¢和5¢-GGACACCUCCCAGAAAGA­ATT-­3¢，由吉玛基因公司设计。Non-silencing siRNA序列为5¢-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3¢。siRNA溶于125 µL DEPC水后，4℃溶解过夜。将对数期细胞接种到6孔板，待细胞长到30%~50%时，用LipofectamineTM2000 (Invitrogen)转染。5 µL siRNA 和LipofectamineTM2000分别溶于250 µL Opti- MEM(Gibco)，放置5 min混匀，室温放置20 min。6孔板中细胞用PBS洗2次后，用少量无血清无抗生素RPMI 1640洗一次，加入2 mL RPMI 1640。将上述混合液加入6孔板中，混匀，37℃含5%CO2的培养箱中培养4~6 h，换成含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养24~48 h。

1.5 载体构建

以食管正常上皮组织cDNA为模板，扩增基因CDS全长。上游引物为5¢-TAAAAG­CTTCGATGGCCTCGGCAGCTG-3¢，下游引物为 5¢-TGCTCTAGACGTCCCCCTCTCCTTCCT-3¢。PCR扩增体系如下：模板1 µL，2×GC buffer 10 µL，dNTP (2.5 mmol/L)1.6 µL，引物(10 µmol/L)1 µL，PrimeStar (2.5 U/µL)0.2 µL，ddH2O 6.2 µL。PCR扩增程序如下：98℃预变性5 min；98℃ 15 s，60℃ 5 s，72℃ 3 min，30次循环；最后再72℃延伸7 min。将PCR片段和空载体pcDNA3.1于37℃双酶切6 h(体系为：PCR片段900 ng，空载体900 ng，d Ⅲ 1 µL，Ⅰ 1 µL，10×M 2 µL，Nonclease-free water补足至20 µL体系)，载体酶切产物经电泳后切胶纯化回收，PCR片段酶切产物直接回收，回收产物载体和模板以1:3 pmol的比例，16℃在Solution I(TaKaRa)作用下进行连接16 h。将连接产物pcDNA3.1-IGHMBP2转化入Trans5α感受态细胞(TransGen Biotech)，经菌液PCR鉴定，选取阳性克隆测序验证。

1.6 细胞侵袭和迁移实验

敲降或正转质粒的细胞消化收集后，用不含血清的RPMI 1640悬浮细胞并计数。在细胞迁移实验中，Transwell小室内加入200 µL含1×105个细胞的悬液，对应24孔板中加入700 µL含20%血清的RPMI 1640，将加好的Transwell板置于5%CO2培养箱中培养(KYSE30培养24 h，KYSE150培养36 h)，取出培养板，使用PBS将小室洗2次，置于固定液中(甲醇:丙酮=1:1)固定20 min，0.5%结晶紫染色30 min，水洗2~3次。将膜置于载玻片上，滴加中性快干胶后用盖玻片封片，镜下拍照计数。细胞侵袭实验需提前将Matrigel胶置于4℃解冻，用无血清的RPMI 1640稀释至终浓度300 ng/µL，加50 µL于Transwell 小室，室温晾至1 h，吸出后用RPMI 1640洗2次，然后加入200 µL含1×105个细胞的悬液，对应24孔板中加入700 µL含20%血清的RPMI 1640，于5%CO2培养箱中培养(KYSE30培养24 h，KYSE150培养36 h)，取出培养板，使用PBS清洗2次，固定、染色及封片步骤同细胞迁移实验。

1.7 细胞增殖检测

敲降处理48 h后，消化收集细胞，进行计数。96孔板内每孔加入含1000~2000个细胞的200 µL悬液。每组至少设3个平行孔和空白对照孔，共接种7板，37℃、5%CO2培养箱中培养，每天取出一块96孔板进行检测。CCK-8用RPMI 1640按1:10稀释，每孔加入100 µL的CCK-8稀释液，37℃培养箱培养1 h，酶标仪(BioTek)测定450 nm(450)吸光值。以不同处理组的450为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。

1.8 统计方法

应用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学分析。两组间均数的比较采用检验两组以上均数间的比较采用单因素方差分析。<0.05代表具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 IGHMBP2在食管鳞癌细胞中扩增和过表达

本文对本实验室前期报道的59例食管鳞癌原发肿瘤array-CGH数据(GEO编号：GSE46452)进行进一步分析，结果显示的扩增频率为28.9%(17/59)(图1A)。对8个食管鳞癌细胞系进行了FISH检测，结果显示在KYSE30、KYSE180和KYSE510中呈现扩增，在KYSE70、KYSE150、KYSE410和KYSE450中呈现增益，在Colo680N中未扩增(图1B)。Western blot结果显示，在未扩增的细胞系Colo680N中，其蛋白表达水平较低；在增益的4个细胞系(KYSE70、KYSE150、KYSE410和KYSE450)中，蛋白表达量高于未扩增的细胞系Colo680N；而在扩增的3个细胞系(KYSE30、KYSE180和KYSE510)中，蛋白表达水平最高。

图1 IGHMBP2基因在食管鳞癌的扩增及蛋白表达情况

A：array-CGH分析(定位于11q13.2)在食管鳞癌原发肿瘤扩增。每一个红色方块代表一个探针。纵坐标代表基因拷贝数的log2ratio值，该值为0时代表基因无拷贝数改变，大于0为扩增。B：FISH结果。基因探针NONSC29F5(Cy3- dUTP，红色)的信号明显多于CEP11(FITC-dUTP，绿色)的信号，表明该基因存在扩增；基因探针与CEP11均具有3个信号，表明存在增益；基因探针与CEP11均具有2个信号，表明未扩增。C：Western blot结果。

2.2 IGHMBP2过表达促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力

选取IGHMBP2蛋白水平表达较高的KYSE30和KYSE150细胞，检测其对细胞的侵袭和运动能力的影响。结果显示，KYSE30和KYSE150中敲降IGHMBP2后，食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力明显降低(<0.001)(图2：A，B)；在敲降IGHMBP2后的KYSE30和KYSE150中，回复IGHMBP2的表达后，两种细胞的侵袭和迁移能力均得到恢复(<0.01) (图2：C，D)。

为了排除细胞增殖对上述实验结果的影响，本文同时检测了IGHMBP2敲降对细胞增殖能力的影响。结果显示，敲降和未敲降IGHMBP2的KYSE30细胞增殖速度始终较为接近；对于敲降和未敲降IGHMBP2的KYSE150细胞，在48 h内的增殖速度也较为接近(图2E)，表明IGHMBP2 敲降对细胞侵袭和迁移能力的影响与细胞增殖无关，由此可以排除细胞增殖对上述Transwell实验结果的影响。

图2 IGHMBP2过表达显著增强食管鳞癌细胞的侵袭迁移能力

A：KYSE30和KYSE150中敲降IGHMBP2后，聚碳酯膜下表面每个视野的细胞数在敲降组明显低于对照组和亲本组细胞数；B：3次实验统计结果(mean ± SD，***代表<0.001)；C：KYSE30和KYSE150中敲降后聚碳酯膜下表面每个视野的细胞数减少，敲降后正转IGHMBP2，每个视野的细胞数增多；D：3次实验统计结果(mean ± SD，**代表<0.01)；E：敲降IGHMBP2后食管鳞癌细胞的增殖情况。2个细胞系敲降48 h内的增殖速度与对照组比较均无显著变化。

2.3 敲降IGHMBP2能够上调E-cadherin蛋白表达

为了明确该基因在食管鳞癌细胞侵袭迁移恶性表型中作用，本文分析了IGHMBP2对细胞侵袭迁移相关分子的影响。结果显示敲降IGHMBP2后，KYSE30中E-cadherin蛋白的表达水平升高，且KYSE150中E-cadherin蛋白的表达水平也略微升高，而β-catenin蛋白表达水平均未见明显变化(图3)。

图3 敲降IGHMBP2后E-cadherin蛋白表达上调

3 讨 论

染色体拷贝数改变和结构异常是食管鳞癌常见的特征，可能与肿瘤的发生和进展有关。食管鳞癌中3q26、8q24、11q13等区段的扩增和3p14、16p13、18q22等区段的丢失是常见的染色体异常[15,17,18]。位于11q13染色体的CCND1是从G1期到S期的重要调节因子，其扩增与食管鳞癌进展和患者预后相 关[19]。一些癌症相关基因，如、和等均位于11q13区段，基因也位于此区段。本文在28.9%的食管鳞癌原发肿瘤中检测到扩增，还发现该基因在食管鳞癌细胞KYSE30、KYSE180和KYSE510中扩增且高表达。该基因在KYSE150中未扩增，但存在增益，而且其蛋白表达水平也较高。

1993年，Mizuta等[20]分离了编码IGHMBP2蛋白的小鼠cDNA序列，其特异结合于富含G嘌呤的5¢-磷酸化的单链DNA，编码蛋白属于解旋酶超家族，参与DNA复制、重组和修复。Fukita等[21]克隆了人同源IGHMBP2蛋白的cDNA序列，发现其含解旋酶序列，可能参与免疫球蛋白µ链的转换。Liepinsh等[22]通过核磁共振光谱学解析了人IGHMBP2的R3H结构域的3D结构，其能够以序列特异性方式结合单链DNA或RNA。在肝癌治疗中，Gemfibrozil可能促进IGHMBP2结合病毒反应组件，然后激活载脂蛋白I(apoA-I)启动子，使apoA-Ⅰ表达水平上调，从而有利于胆固醇转运至肝脏代谢[23]。在神经胶质细胞中，IGHMBP2和其截短体胶质因子1(GF-1)能够调节JC病毒启动子活性，下调JCV病毒的复制水平和上调其转录水平，这一过程可能参与脱髓鞘疾病进行性多灶性脑白质病的发病机制[24]。近期有文献报道IGHMBP2可能是蛋白翻译机制的组成成分之一，可能发挥遗传调控作用进而抑制运动神经元变性[25]。这些研究表明，IGHMBP2是一个多功能蛋白，可能影响转录、重组、翻译等多种细胞功能。本文发现敲降IGHMBP2后，食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力明显减弱，转染IGHMBP2质粒后，食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力又得以恢复，而且排除了增殖对侵袭和迁移能力的影响，表明该基因可能促进食管鳞癌细胞的侵袭和迁移。

侵袭迁移是食管鳞癌细胞发生远端转移的重要步骤，与侵袭迁移相关的一些分子，如MMPs家族是一组锌依赖性内肽酶，参与肿瘤的生长、分化、凋亡、迁移和侵袭变化[26,27]。上皮细胞-间充质转换在癌症侵袭迁移中发挥重要作用，主要特征表现为E-cadherin蛋白的功能缺失以及N-cadherin蛋白上调[28,29]。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活在肿瘤进展过程中的起始阶段也发挥着重要作用[30,31]。本文检测了敲降IGHMBP2后β-catenin及E-cadherin蛋白表达水平的变化，结果显示E-cadherin的表达水平升高，β-catenin的表达未发生明显变化。上述结果提示，IGHMBP2可能是通过调节E-cadherin的表达影响食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力，具体机制有待进一步研究。

综上所述，本文发现基因在食管鳞癌原发肿瘤中存在扩增，在细胞系中存在扩增和蛋白过表达，功能研究提示IGHMBP2过表达可能通过降低E-cadherin的表达，而增强食管鳞癌细胞的侵袭迁移能力。这些发现可能为进一步阐明食管鳞癌细胞侵袭迁移的分子机制提供理论基础。

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(责任编委: 史庆华)

IGHMBP2 overexpression promotes cell migration and invasion in esophageal squamous carcinoma

Chunli Wang1, Jiajie Hao2, Lifei Wu3, Beiqing Pan2, Xin Xu2, Yan Cai2, Mingrong Wang2, Xuemei Jia1

Immunoglobulin mu binding protein 2 () is located in 11q13.2, which is frequently amplified in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).encodes a helicase involved in DNA replication and repair. IGHMBP2 protein also regulates gene transcription. The present study aims to explore the amplification ofand its potential role in ESCC. A further analysis of our previously reported array-CGH data showed thatwas amplified in 28.9% of primary ESCC tumors. Fluorescencehybridization (FISH) and Western blot showed that IGHMBP2was amplified and overexpressed in KYSE30, KYSE180, KYSE510 and KYSE150 esophageal cancer cell lines. Transwell assays demonstrated that knockdown of IGHMBP2 in KYSE30 and KYSE150 inhibited cell invasion and migration, and increased the expression levels of E-cadherin. When rescue plasmids expressing IGHMBP2 were introduced, the abilities of cell invasion and migration were restored. These data suggest that IGHMBP2 overexpression may promote invasion and migration of ESCC cells through down-regulation of E-cadherin.

IGHMBP2; esophageal squamous cell carcinoma; amplification; invasion; migration

2014-10-29;

2014-12-04

国家高技术研究发展计划项目(863计划)(编号：SS2014AA020601)和国家自然科学基金项目(编号：81321091)资助

王春丽，硕士研究生，专业方向：肿瘤遗传学。E-mail: wcl4496@126.com

王明荣，博士，研究员，研究方向：肿瘤遗传学。E-mail: wangmr2015@126.com；贾雪梅，硕士，教授，研究方向：肿瘤遗传学。E-mail: jiaxueme@126.com

10.16288/j.yczz.14-371

2015-1-7 8:50:11

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150107.0850.001.html