Beclin 1表达在胃癌发生和演进中的临床病理意义及作用机制

郑华川，申道福，杨雪峰，时帅，高阳，赵爽，张文陆

（辽宁医学院附属第一医院肿瘤中心，辽宁省脑与脊髓损伤重点实验室，实验动物中心，辽宁 锦州 121001）

Beclin 1表达在胃癌发生和演进中的临床病理意义及作用机制

郑华川，申道福，杨雪峰，时帅，高阳，赵爽，张文陆

（辽宁医学院附属第一医院肿瘤中心，辽宁省脑与脊髓损伤重点实验室，实验动物中心，辽宁 锦州 121001）

目的阐明胃癌发生和演进过程中Beclin 1表达的临床病理意义和分子作用机制。方法胃癌细胞MKN28转染Beclin 1表达质粒，利用CCK-8试剂盒和碘化丙啶染色检测细胞增殖和周期。利用原位杂交和免疫组化检测组织芯片上胃癌、癌旁黏膜和淋巴结转移灶中Beclin 1mRNA和蛋白的表达，比较其与胃癌发生、临床病理特征和预后的关系。结果Beclin 1过表达可以抑制胃癌细胞MKN28增殖并导致细胞周期G2期阻滞，胃癌中Beclin 1mRNA表达高于癌旁黏膜（P＜0.05），Beclin 1蛋白表达与胃癌远处转移呈负相关（P＜0.05），Beclin 1表达病例多见于老年男性（P＜0.05），弥漫型胃癌中Beclin 1表达低于肠型和混合型（P＜0.05）。Kaplan-Meier分析显示，Beclin 1表达与胃癌良好预后呈正相关（P＜0.05）。结论Beclin 1表达与胃癌发生、转移和分化关系密切，可以作为胃癌患者的预后因素和基因治疗的靶标。

胃癌；Beclin 1；疾病发生；演进；预后

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，近年发病率有所下降，但仍然严重威胁人类健康。分子遗传学研究证明胃癌是异型性极高的恶性肿瘤，胃癌发生和发展是多阶段、多基因和多因素参与的复杂过程，这些基因主要包括癌基因、抑癌基因及DNA错配修复基因等［1］。抑癌基因Beclin 1编码蛋白含有Bcl-2同源结构域3（BH3）、卷曲螺旋结构域和进化保守结构域，可以与Vps34、UVRAG、Ambra1和抗凋亡蛋白形成复合体，进而诱导自噬发生且抑制凋亡［2］。Beclin 1等位基因缺失可引发胚胎致死，其杂合性可提高自发肿瘤发生率（如淋巴瘤、肝癌和肺癌），Beclin 1缺失细胞自噬水平降低、增殖水平升高，提示Beclin 1在抑制肿瘤发生方面具有重要作用［3］。本研究拟分析Beclin 1过表达对胃癌细胞增殖和细胞周期的影响，观察胃癌发生和演进中Beclin 1 mRNA和蛋白的表达情况，比较其表达与胃癌临床病理特征和预后的关系，为胃癌恶性生物学行为预警和基因治疗提供分子靶标。

1 材料与方法

1.1 研究对象

于日本神奈川县立癌中心附属医院收集胃癌（n=613）、邻近正常黏膜（n=518，距癌≥4 cm）和淋巴结转移灶（n=190）石蜡标本，其中女性186例，男性427例，年龄24～87岁，平均年龄62.1岁。伴有淋巴结转移的患者265例，伴有肝转移的患者35例。标本获得符合神奈川县立癌中心和辽宁医学院伦理委员会要求，通过电话和病例查询获取胃癌患者的生存信息。临床病理分期和组织分化分别依据UICC的TNM分期标准以及Lauren分型。部分侵袭、淋巴结转移、组织Lauren分型和TNM临床分期信息缺失。

1.2 细胞培养和转染

胃癌细胞MKN28购自ATCC细胞库，于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞利用QIAGEN试剂盒转染pcDNA3.1-Beclin 1表达质粒或者pcDNA3.1载体后G418处理并筛选单克隆。

1.3 细胞增殖检测

使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。于96孔板中每孔铺2.0×103个细胞，待细胞贴壁后在不同时间点加入10 μL CCK-8溶液并培养3 h，最后于450 nm处检测吸光度值。

1.4 细胞周期检测

胰酶消化细胞，PBS漂洗，之后在10 mL冰乙醇中固定2 h以上，再经PBS漂洗后1 mL RNase（0.25 mg/mL）于37℃孵箱中消化60 min，待细胞沉淀后向混悬液中加入碘化丙啶（propidium iodide，PI），使其终浓度为50 μg/mL，4℃下避光孵育30 min，最后经流式细胞仪检测并分析实验结果。

1.5 定量RT-PCR

利用Trizol试剂提取细胞总RNA，AMV酶反转2 μg总RNA成cDNA，Beclin 1（F：5′-GATGGAAGG GTCTAAGACGTCCAA-3′，R：5′-TTTCGCCTGGGCT GTGGTAAG-3′）和内参GAPDH（F：5′-CAATGAC CCCTTCATTGACC-3′，R：5′-TGGAAGATGGTGAT GGG ATT-3′）引物依据GenBank序列进行设计，定量PCR操作依据SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒（日本TaKaRa公司）说明书进行操作。

1.6 Western blot

胃癌细胞在RIPA裂解液中超声破碎，蛋白定量后变性，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转印，使蛋白转移至PVDF膜上，之后膜经5%脱脂奶粉封闭后用Beclin 1或者β-actin（美国Santa Cruz公司）一抗孵育60 min，室温下用IgG-HRP二抗孵育60 min，孵育后均用TBST漂洗3次，每次5 min，最后ECL-Plus检测试剂显色并在LAS4010中获取信号。

1.7 组织芯片制备

在HE指导下选取代表性组织结构部位，规格为2 mm的48阵列组织芯片利用组织芯片机（KIN-1，日本AZUMAYA公司）构建获得，4 μm厚度切片备用。

1.8 原位杂交

以MKN28细胞cDNA为模板，利用PCR方法，采用地高辛－dUTP标记Beclin 1探针。组织切片经过脱蜡至水，20 μg/mL蛋白酶消化30 min，预杂交后42℃探针孵育过夜，切片经TBST漂洗后加上抗地高辛的碱性磷酸酶抗体孵育1 h，切片碱化后NBT/ BCIP显色，甲基绿复染。Beclin 1 mRNA定位于细胞质中（图2）。随机选取5个视野并计数100个细胞，按如下标准分级：阴性（-），0%～5%；弱阳性（+），＞5%～25%；中度阳性（++），＞25%～50%；强阳性（+++），＞50%。

1.9 免疫组化

切片脱蜡至水，并将其放置于TRS抗原修复液中微波炉加热修复15 min，之后用10%双氧水封闭内源性的过氧化物酶，牛血清白蛋白第Ⅴ组份封闭非特异性着色。抗兔Beclin 1抗体（美国Sigma公司，1∶50）和抗兔HRP二抗分别孵育15 min，所有反应都在间歇照射微波炉中进行［1］，每次孵育后TBST漂洗，最后DAB显色，Mayer’s苏木素复染，脱水透明封片。去除一抗作为阴性对照。Beclin 1蛋白定位于细胞质中。随机选取5个视野并计数100个细胞，按如下标准分级：阴性（-），0%～5%；弱阳性（+），＞5%～25%；中度阳性（++），＞25%～50%；强阳性（+++），＞50%。

1.10 统计学分析

应用SPSS 10.0统计软件分析数据，采用t检验比较组间平均值，Spearman相关分析等级资料，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank分析确定生存率差别。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Beclin 1过表达对胃癌细胞恶性增殖和细胞周期的影响

RT-PCR和Western blot结果提示，Beclin 1质粒在MKN28细胞中成功表达，Beclin 1mRNA和蛋白均表达增高（图1A），阴性和空白对照组细胞增殖速度要快于Beclin 1转染体（图1B），PI染色结果显示稳定转染Beclin 1的胃癌细胞出现了G2期阻滞（图1C、1D）。

图1 Beclin 1过表达影响胃癌细胞的增殖Fig.1 Influence of Beclin 1 overexpression on the proliferation of gastric cancer cells

2.2 胃癌发生中Beclin 1mRNA和蛋白表达

如图2所示，Beclin 1mRNA信号主要定位于黏膜上皮腺体和胃癌细胞胞质中。统计结果显示，原发癌（81.6%，31/38）中Beclin 1mRNA表达高于癌旁黏膜（64.6%，31/48）（P＜0.05），而原发癌与淋巴结转移灶（93.3%，28/30）中Beclin 1mRNA表达未见统计学差异（P＞0.05），见表1。Beclin 1蛋白定位于浅表肠化生黏膜上皮细胞和胃癌细胞胞质中，统计结果表明癌旁黏膜（60.1%，352/586）、原发癌（56.6%，320/565）和淋巴结转移灶（52.7%，88/167）中Beclin 1蛋白表达无统计学差异（P＞0.05）。见表2。

2.3 Beclin 1表达与胃癌病理特征和预后的关系

如表3所示，Beclin 1蛋白表达与胃癌远处转移呈负相关（P＜0.05），与患者肿瘤侵袭深度、淋巴和静脉侵袭、淋巴结转移和TNM分期无显著相关性（P＞0.05），Beclin 1表达多见于老年男性（P＜0.05），弥漫型胃癌中Beclin 1表达低于肠型和混合型（P＜0.05）。随访504例胃癌患者，中位生存时间68.5个月，Kaplan-Meier分析显示Beclin 1表达与胃癌患者良好预后呈正相关（P＜0.05，图3）。

3 讨论

Beclin 1是自噬小泡必需的自噬蛋白，能够参与细胞正常生理生长，阻碍细胞周期演进，诱导细胞自噬［2，3］。与结直肠癌的结果一致［4］，胃癌中Beclin 1 mRNA表达上调，提示Beclin 1转录水平上调参与胃黏膜上皮细胞恶性转化过程，该过程可能为了抑制胃癌恶性行为的反应性升高。此外，本研究发现胃癌和黏膜中Beclin 1蛋白表达水平接近，Beclin 1 mRNA化学稳定性、翻译和翻译后降解可为此提供科学的解释。胃癌组织中Beclin 1蛋白表达阳性率仅为50%，靶向敲除Beclin 1可以作为制备自发胃肿瘤模型的策略（工作正在进行中），而且监控Beclin 1表达可以作为其靶向治疗适应证筛选的方法。

图2 胃癌和癌旁黏膜组织中Beclin 1 mRNA和蛋白表达Fig.2 The mRNA and protein expression of Beclin 1in gastric cancer and mucosa

表1 胃癌发生和发展过程中Beclin 1mRNA表达Tab.1 Beclin 1mRNA expression in gastric carcinogenesis and subsequent development

表2 Beclin 1蛋白在胃癌发生和发展过程中的表达Tab.2 Beclin 1 protein expression in gastric carcinogenesis and subsequent development

图3 Beclin 1蛋白表达与胃癌患者预后的关系Fig.3 Correlation between Beclin 1 status and prognosis of the gastric cancer patients

本研究发现，Beclin 1表达与胃癌远处转移呈负相关，提示胃癌中抑癌基因Beclin 1表达可能发挥转移抑制作用。研究表明，Beclin 1低表达与肝内胆管癌的淋巴结转移［5］、非小细胞肺癌肿块大小［6］以及胰腺导管腺癌远处转移［7］显著相关。有文献［4，8］报道，结直肠癌中Beclin 1表达与远处转移和肝转移呈负相关，Beclin 1过表达减慢了结肠癌细胞的增殖并使细胞周期在G1期阻滞，与本研究结果相一致。此外，本研究发现弥漫型胃癌中Beclin 1表达低于肠型胃癌，说明Beclin 1差异表达是胃癌分化的分子基础。在此，我们也发现Beclin 1表达水平与胃癌良好预后呈正相关，与肝内胆管细胞癌［6］、胰腺导管腺癌［7］、ⅢB结肠癌［9］和鼻型结外自然杀伤T细胞淋巴瘤［10］的报道一致，提示Beclin 1对于反映胃癌患者良好预后来说是一个很好的分子标志。

本课题组一系列实验结果表明Beclin 1表达参与胃癌发生过程，其表达下调与胃癌远处转移、去分化和不良预后关系密切，可以作为预警胃癌发生和预后的分子标志，因其可抑制增殖和细胞周期演进，所以可作为胃癌基因治疗的靶标。

［1］Zheng HC，Li XH，Hara T，et al.Mixed-type gastric carcinomas exhibit more aggressive features and indicate the histogenesis of carcinomas［J］.Virchows Arch，2008，452（5）：525-534.

表3 胃癌中Beclin 1蛋白表达与其临床病理特征的关系Tab.3 Relationship between Beclin 1 protein expression of gastric cancer and its clinicopathological features

［2］Kang R，Zeh HJ，Lotze MT，et al.The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis［J］.Cell Death Differ，2011，18（4）：571-580.

［3］Qu X，Yu J，Bhagat G，et al.Promotion of tumorigenesis by heterozygous disruption of the Beclin 1 autophagy gene［J］.J Clin Invest，2003，112（12）：1809-1820.

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（编辑 陈 姜）

Clinicopathological Significance and Relevant Molecular Mechanisms of Beclin 1 in Gastric Cancer

ZHENG Hua-chuan，SHEN Dao-fu，YANG Xue-feng，SHI Shuai，GAO Yang，ZHAO Shuang，ZHANG Wen-lu

（Cancer Center，Key Laboratory of Brain and Spinal Cord Injury of Liaoning Province，Laboratory Animal Center，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

ObjectiveTo explore the role of Beclin 1 in gastric carcinogenesis and subsequent progression.MethodsMKN28 cells were transfected with Beclin 1-expressing plasmid，and then the proliferation and cell cycle was measured by CCK-8 and PI staining.Beclin 1 expression was examined by immunohistochemistry and in situ hybridization on tissue microarrays containing gastric cancers，adjacent non-neoplastic mucosa，and metastatic lymph node.The correlation with the tumorgenesis，clinicopathological and prognostic parameters was analyzed.ResultsBeclin 1 overexpression resulted in G2arrest of MKN28 cells and reduced the proliferation.Beclin 1 mRNAwas highly expressed in gastric cancer than matched mucosa by ISH（P＜0.05）.Beclin 1 was highly expressed in male than female patients with gastric cancer（P＜0.05）.The elder patients with gastric cancer had higher Beclin 1 expression than younger ones（P＜0.05）.The diffuse-type carcinomas showed less Beclin 1 expression than intestinal and mixed type ones（P＜0.05）.Kaplan-Meier analysis indicated that Beclin 1 expression was positively correlated to favorable prognosis of the cancer patients（P＜0.05）.ConclusionBeclin 1 expression is closely linked to pathogenesis，metastasis and differentiation ofgastric cancer.Beclin 1 mightbe employed to indicate the favorable prognosis of gastric cancer patients and regarded as a target of gene therapy.

gastric cancer；Beclin 1；pathogenesis；progression；prognosis

R731

A

0258-4646（2015）12-1061-05

国家自然科学基金（81172371，81472544）；辽宁省教育厅优秀人才计划（LJQ2014093）；辽宁省科学技术厅2012年博士启动资助项目（20121095）；辽宁医学院2012年博士启动项目（Y2012B018）；辽宁医学院校长基金（XZJJ20140201，XZJJ20140203）

郑华川（1975-），男，教授，博士.

E-mail：zheng_huachuan@hotmail.com

2015-03-24

网络出版时间：