家蝇幼虫防御素基因MddⅠ在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性鉴定

傅小蒙，万 玲，唐艳,孔令聪，裴志花，刘树明，马红霞,2*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118;2.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林农业大学，长春 130118)



家蝇幼虫防御素基因MddⅠ在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性鉴定

傅小蒙1，万 玲1，唐艳1,孔令聪1，裴志花1，刘树明1，马红霞1,2*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118;2.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林农业大学，长春 130118)

根据家蝇幼虫防御素基因(MddI)序列，设计合成含有KpnI和XbaI酶切位点的特异性引物，PCR扩增出MddI基因全长序列。克隆并测定序列后，构建真核表达质粒pGAPZαA-MddI，将其在毕赤酵母(P.pastoris)GS115中分泌表达，并对表达产物进行抑菌活性分析。结果表明，MddI基因在P.pastoris中成功表达，分子量约为10.3kDa，抑菌结果显示MddI基因的真核表达产物对猪源链球菌有抑制作用。该试验成功构建了表达MddI基因的P.pastoris菌株，为进一步研究MddI真核表达产物的生物学活性和免疫学活性奠定了基础。

家蝇；防御素；P.pastoris；真核表达；抗菌活性

家蝇是地球上分布极其广泛的一种昆虫，长期生活在杂菌横生的环境中，研究报道其独特的抗病能力可能源于其体内所含有的多种抗菌活性物质，而防御素就是其中之一[1-2]。家蝇防御素可抑制多种病原微生物的生长，尤其对耐药的革兰氏阳性菌有很强的杀伤作用[3]，在抗生素耐药性日趋严重的情况下，利用基因工程的方法大量制备抗菌肽产品具有广阔的研究前景。由于防御素对细菌有很强的杀伤作用[4]而不易在细菌中高效表达，且其在原核系统中的表达具有不能正确折叠，缺少翻译后的修饰等[5]缺点，而P.pastoris表达系统具有比较完备的基因表达调控机制和对真核基因表达产物的加工修饰能力，是一个较为理想的抗菌肽基因表达系统[6]。家蝇幼虫防御素基因MddI是家蝇防御素Defensin-2家族中的一员，与GenBank中登录号为AY260152的家蝇防御素基因同源性最高，达到76%。本研究构建了表达MddI基因的重组酵母菌株，对MddI基因进行了真核表达及表达产物活性研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与表达载体 大肠杆菌DH5α菌株、P.pastorisGS115菌株、pGAPZαA载体、猪源链球菌耐药株、鸡源大肠杆菌耐药株与鸡伤寒沙门氏菌耐药株，均由吉林农业大学兽医药理实验室保存。

1.1.2 主要试剂与酶 限制性内切酶KpnI、XbaI、BlnI，T4 DNA连接酶，低分子量标准蛋白Marker(14.3～97.2 kDa)，DNA Marker(DL2000，λ-HindⅢ)均购自宝生物工程有限公司；博来霉素(Zeocin)购置Invitorgen公司；考马斯亮蓝G-250、溴酚蓝、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、Tris、甘氨酸与十二烷基磺酸钠,均购自北京鼎国生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1MddI的克隆 根据MddI基因序列[7]，应用Primer5.0软件设计两条特异性引物，序列为P1：ATTAGGTACC GCCACC ATGAAATTC，其中第一条与第二条下划线序列分别为KpnI限制性内切酶酶切位点与Kozak序列[8]；P2：GGCCTTAATTTCTAGATCAGTTACG，下划线部分为XbaI限制性内切酶酶切位点。设计的引物送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。利用两条特异性引物，PCR扩增出MddI基因目的片段后与pMD-18T克隆载体进行连接，对克隆质粒进行双酶切验证分析，并将阳性克隆质粒送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.2.2 重组毕赤酵母表达质粒pGAPZαA-MddI的构建 将T-A克隆成功的质粒与pGAPZαA载体经KpnI和XbaI双酶切后，回收并连接，构建pGAPZαA-MddI真核表达质粒，并对其进行双酶切验证和测序分析。

1.2.3 酵母的电击转化及重组酵母菌株的筛选P.pastorisGS115感受态细胞的制备参照Invitorgen公司提供的毕赤酵母表达手册进行[9]。通过电击转化的方法将经过BlnI单酶切线性化的重组表达质粒转化入GS115感受态细胞(电转参数1500 V、25 μF、200 Ω)。转化后将酵母细胞涂布于含100 μg/mL Zeocin的 YPDS平板上，30 oC培养2～3 d，挑取转化子，用特异性引物对转化子进行PCR鉴定。再经不同浓度梯度博来霉素的YPDS 平板筛选高拷贝重组转化子。

1.2.4MddI基因在毕赤酵母中的表达 pGAPZαA为组成型表达载体，非诱导表达参照Invitrogen 公司推荐的非诱导表达程序进行[10]，挑取高拷贝重组表达酵母菌株于5 mL 的YPD (含100 μg/mL Zeocin)液体培养基中进行培养，OD600nm达到2～6 时取1 mL 培养液，重悬于50 mL 的YPD液体培养基中，每隔24 h 取1 mL 培养液，收集上清进行Tris-SDS-PAGE分析。

1.2.5 表达产物抑菌活性检测 大量收集酵母表达上清，并用3 kDa的超滤管进行浓缩脱盐，取浓缩后的上清进行抑菌活性检测。以本实验室在临床分离的几种耐药菌株(猪源链球菌耐药株、鸡源大肠杆菌耐药株与鸡伤寒沙门氏菌耐药株，)为试验菌，采用管碟法测定表达上清对这些耐药菌株的敏感性。

2 结果与分析

2.1MddI基因PCR扩增结果MddI基因PCR扩增产物经过1% 琼脂糖电泳检测显示，获得约为282 bp的目的片段，与预期大小相符(图1)。

M：DNA分子量标准DL2000； 1：PCR扩增的Mdd I基因

2.2MddI基因T-A克隆结果 pMD-18T-MddI克隆质粒的双酶切鉴定结果显示，在282 bp处有一条清晰条带，与目的片段预期大小一致(图2)。

M：DNA分子量标准DL2000； 1：pMD-18T-Mdd I双酶切

2.3 重组表达质粒pGAPZαA-MddI双酶切鉴定结果 pGAPZαA-MddI经KpnI和XbaI双酶切后，在282 bp处切出目的条带，证明真核表达质粒构建成功(图3)。

M：DNA分子量标准DL2000；1： pGAPZαA-Mdd I质粒双酶切

2.4 重组阳性表达质粒单酶切鉴定结果 pGAPZαA-MddI经过BlnI单酶切线性化后，在3382 bp处出现目的条带(图4)。

M：DNA分子量标准λ-HindⅢ； 1：pGAPZαA-Mdd I单酶切

2.5 重组阳性酵母表达菌株GS115/ pGAPZαA-MddI PCR鉴定结果 挑取在YPDS平板上生长的菌落于YPD液体培养基中，利用特异性引物对过夜培养的菌液进行PCR验证，阳性酵母表达菌株在282 bp处出现目的条带，证明重组表达质粒已成功转入P.pastorisGS115中(图5)。

M：DNA分子量标准DL2000；1：GS115阴性对照；2：GS115/ pGAPZαA-Mdd I

2.6 GS115/ pGAPZαA-MddI重组酵母表达产物Tris-SDS-PAGE检测 收集酵母表达上清进行Tris-SDS-PAGE分析，结果显示，在14.3 kDa之下有一明显重组表达条带(图6)。

M: Protein Marker；1：GS115/ pGAPZαA空载体对照；2：GS115/ pGAPZαA-Mdd I酵母表达上清

2.7MddI重组酵母表达产物抑菌活性检测 抑菌活性检测结果显示MddI重组酵母表达产物对猪源链球菌耐药株具有显著的抑制作用，而对鸡源大肠杆菌耐药株、鸡伤寒沙门氏菌耐药株无明显抑制作用(图7)。

a：GS115/ pGAPZαA-Mdd I酵母表达上清；b：阴性对照

3 讨论与小结

与传统抗生素相比，防御素作为一种新型的抗菌肽，其独特的作用方式使细菌不易产生耐药性[11]。本试验在研究MddI基因的抑菌活性时，发现其对革兰阴性菌无明显抑制作用，而对革兰阳性菌的抑制效果十分显著，这与先前报道的家蝇防御素对革兰阳性菌敏感度较高这一结论相符。防御素发挥抗菌作用主要有细胞膜渗透机制、与细胞内生物大分子作用以及诱导调节机体免疫反应三种方式[12-13]，MddI基因致革兰阳性菌死亡属于上述哪种机制还有待于进一步论证。

P.pastoris表达系统具有许多原核表达系统无法比拟的优点，例如分子遗传操作技术简单，具有多种翻译后加工修饰能力等[14]。本研究选用P.pastorisGS115菌株和pGAPZαA载体表达MddI基因主要有两点原因：一为P.pastorisGS115是组氨酸缺陷型酵母菌株，而表达载体上携带的组氨酸基因，可补偿宿主的组氢酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子，二为pGAPZαA是组成型分泌表达载体，具有PGAP启动子(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)，在它控制下的外源基因表达率比甲醇诱导下的以PAOX1为启动子的产量更高，并且PGAP为组成型启动子不需甲醇诱导，发酵工艺简单且生产过程安全，是一个很有潜力的启动子。

本研究为了提高防御素基因在P.pastoris表达系统中的表达量，设计合成引物时，在起始密码子前加入了Kozak序列，有研究证明在起始密码子前后加入Kozak序列(GCCACC)，基因开始转录翻译的效率最高[8]。本研究Tris-SDS-PAGE分析结果显示，表达的目的蛋白相对分子量略微偏大，参考Invitrogen 公司酵母表达手册分析得出原因，可能是由于蛋白在翻译加工时，C-末端2.5 kDa的标签未能成功切割所致。本试验结果为进一步研究MddI基因真核表达产物的生物学活性和免疫学活性奠定了基础。

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(编辑：侯向辉)

Expression ofMuscadomesticaLarvae Defensin GeneMddI inP.pastorisand Identification of Its Antibacterial Activity

FU Xiao-meng1, WAN Ling1, TANG Yan1, KONG Ling-cong1, PEI Zhi-hua1, LIU Shu-ming1, MA Hong-xia1,2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China; 2.AnimalProduction&ProductQualityandSecurityoftheMinistryofEducation,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

A pair of primers with restriction sitesKpnI andXbaI were designed and synthesized according to the gene sequence ofMuscadomesticalarvae defensin geneMddI, then facilitated to amplify the full-length sequence ofMddI by polymerase chain reaction (PCR). After cloning and sequencing, the eukaryotic expression plasmid pGAPZαA-MddI was constructed and then expressed inP.pastorisGS115, subsequently the antimicrobial activity of recombinant protein was analyzed. The result showed that the expressed protein ofMddI was about 10.3 kDa, which possessed antibacterial activity against swine Streptococcus. Conclusively, the recombinantP.pastoriswith geneMddI was successfully constructed, which was a basis for further researchers in biological and immunologic activities of eukaryotic expression product ofMddI.

Muscadomestica; defensin;P.pastoris; eukaryotic expression; antimicrobial activity

国家自然科学基金资助项目(31140026)；吉林省世行贷款农产品质量安全项目(2011-Y05)

傅小蒙，硕士研究生，从事动物药理与毒理学的研究。

马红霞。E-mail：hongxia0731001@163.com

2015-07-05

A

1002-1280 (2015) 10-0022-05

S852.743