引进观赏芍药新种质的SSR指纹图谱构建1)

张建军 季丽静

(北京林业大学，北京，100083) (国家花卉工程技术研究中心(北京林业大学))

刘仲赫 周明洁 王雅丽 于晓南

(北京景山公园) (北京林业大学)

引进观赏芍药新种质的SSR指纹图谱构建1)

张建军 季丽静

(北京林业大学，北京，100083) (国家花卉工程技术研究中心(北京林业大学))

刘仲赫 周明洁 王雅丽 于晓南

(北京景山公园) (北京林业大学)

采用SSR标记构建从欧美等地区引进、收集的61份观赏芍药新种质的指纹图谱。根据引物的多态性信息含量和Shannon遗传多样性指数大小，从15对候选引物中筛选出10对多态性高且稳定性好的引物作为核心引物，首次构建了61个观赏芍药新种质指纹图谱，并编制了指纹代码。结果表明：被试种质资源的倍型丰富，有一条带、两条带，甚至出现了三条带、四条带；所绘制的图谱能够将所有品种(种)完全区分开。

芍药新种质；SSR；引物；DNA指纹图谱；品种鉴定

We used SSR markers to construct the fingerprint of 61 ornamental peony resources mainly collected from European and North American regions. With the polymorphism information and Shannon diversity indexes of primer, we selected 10 pairs of primers from 15 candidates as core primers with high polymorphism and good stability. Fingerprint of 61 new peony resources were first built and fingerprint code was compiled. The ploidy type were with rich varieties including one, two, three and four belts. The map could be used to distinguish all the cultivars (species), and identify the cultivars and ploidy diversity, and provides utility guideline for new peony resources.

芍药自先秦以来就有记载，是深受我国人民喜爱的传统名花[1]。其花容俏丽，花姿富贵，自古就有“花相”之誉[2]。在世界范围内，芍药也是广受欢迎的优良花卉，在西方园艺界，芍药远比牡丹享誉盛名[3-4]。随着市场的开放，芍药优良的观赏特性和切花品质逐渐为世界各地越来越多的人们认识，市场需求空前提高[5]。

芍药种质资源丰富，从全世界范围来看，按其种源组成不同分为中国芍药品种群、欧洲芍药品种群、杂种芍药品种群三类[6-7]。与单一起源(Paeonia.lactiflora)的中国芍药品种群相比，欧洲及杂种芍药品种群混合了P.lactiflora以外的种源，文中的观赏芍药新种质，特指芍药科(Paeoniaceae)芍药属(PaeoniaL.)芍药组(Sect. Paeonia)中的多年生宿根花卉，它们均来自欧洲、美洲等地区，其亲本混合了P.lactiflora以外的种源，很多原种或品种都曾作为重要亲本参与了世界芍药品种的培育，在观赏特性和生态适应性方面表现优异，极大丰富了芍药属种质资源。因而，在观赏特性和生态适应性方面与单一起源的中国芍药品种群有较大差异。然而，欧美芍药品种由于长期育种栽培，遗传背景复杂，加上大多品种收集者为苗圃主或园艺爱好者，有些品种育种年代久远，育种记录缺失等，使得亲缘关系模糊，品种间的遗传差异越来越小，仅仅依据形态进行品种间的田间检测越来越困难。同时，由于形态鉴定的时效性差，容易受到环境和主观因素的影响[8]，导致品种混淆的问题越来越突出，使得后续的育种及应用受到了较大的限制[9]。DNA指纹图谱主要是指基于DNA基础上的某一个品种区别于其他品种的特异性DNA片段[10]，因其简单快速、准确可靠以及便于自动化等优点，使得其在观赏植物种质鉴定中受到广泛的应用[11-13]。已经运用RAPD、SCAR、AFLP、SSR等分子标记手段成功开展了大量的研究[14-18]。与其他分子标记相比，SSR标记重复性与多态性好，在基因组中丰度较高，以孟德尔方式遗传，呈现共显性等优点而在DNA指纹鉴定上显示了其独特的优越性[19]。目前，指纹图谱在观赏芍药中研究较少，仅朱红霞等[20]运用AFLP技术开展过相关研究，而针对SSR标记进行指纹图谱构建的研究还未有相关的报道。

本试验通过SSR标记构建观赏芍药部分新种质指纹图谱，为进行种质鉴定和品种倍性辅助分析提供了技术支持，也对理清芍药品种亲缘关系，科学利用新优种质资源，推动育种工作的深入开展积累了研究基础，具有重要意义。

1 材料与方法

所有61份芍药新优种质资源分别来自荷兰、美国、加拿大、日本，目前均栽种于国家花卉工程研究中心(北京林业大学)芍药种质资源苗圃中(北京，小汤山)和北京景山公园(表1)。

表1 芍药新优种质资源

DNA提取：芍药遗传多样性研究中采用不需要经过水浴和氯仿抽提的试剂盒法(天根，DP320)进行芍药品种基因组DNA提取，操作步骤按说明书进行。提取芍药基因组DNA后(图1)，置于冰箱-20 ℃，备用。

M为DNA标记DL2000；1-6为芍药叶片DNA提取效果。

引物筛选：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对芍药遗传多样性研究中运用磁珠富集法设计、开发的50对SSR引物进行多态性筛选(图2)，初步筛选出来15对多态性引物(表2)作为进行指纹图谱构建研究的候选引物。

图2 多态性引物的筛选

荧光引物检测：将开发的15对引物应用于61份材料，均扩增出清晰的条带(图3)。

SSR-PCR扩增：将所设计的引物进行PCR扩增反应，扩增反应采用优化的25 μL体系。反应液中包括：17.8 μL ddH2O、2.5 μL 10×PCR buffer、1.7 μL MgCl2(2.5 mmol)、0.6 μL Forward primer(10 μmol)、0.6 μL Reverse primer(10 μmol)、0.5 μL dNTPs(2.5 mmol each)、1.0 μL模板DNA和0.3 μL Taq DNA聚合酶。反应程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；共35个循环。72 ℃延伸5 min；10 ℃保存待用。将V(PCR产物)∶V(98%甲酰胺+10 mmol EDTA ph8.0+0.25%溴酚蓝+0.25%二甲苯青)=5∶5混合后迅速放入PCR仪中95 ℃变性5 min；分离取出变性产物立即放入冰水混合物中待用；插梳，采用排枪小心上样，恒功率90 W电泳70 min。银染检测扩增产物。

表2 15对芍药SSR标记引物序列(筛选后)

注：引物序号按微卫星序列数1-63编号，列出的为重复序列8个以上可用于设计引物的50个微卫星中筛选后的15个候选引物序列。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性分析

2.2 指纹图谱构建

根据引物多样性信息筛选核心引物和SSR扩增产物在凝胶上的相对位置，参照宋红梅等[21]、雷天刚等[22]的方法分别对引物与显示的谱带进行赋值，并按照数字与字母结合的方法排序，编写指纹代码(表4)，利用Excel2010版作图工具，绘制了61个芍药品种的DNA指纹图谱。所构建的指纹图谱能够很好地代表各品种的特异性。

图3 引物在不同个体内的荧光检测

本试验通过采用上述10对引物对61个芍药品种(种)进行指纹分析。从绘制的指纹图谱中可知，这些芍药新种质不再是传统意义上仅有一条带、两条带的二倍体类型，而是出现了三条带、四条带。从细胞水平上可知，芍药倍型非常丰富，已知的野生种中就有二倍体种，如P. lactiflora、P. tenunata、P. sterniana，四倍体种P. officinalis、P. dauricasubsp. macrophylla、P. peregrina等，故其品种的倍性必然也会多样化。欧美地区培育芍药新品种因其野生种源倍性的多样化，其品种也呈现多样性趋势。‘Halcyon’在sy16、sy45、sy55等三条引物中表现三条带；‘HenryBockstoce’在sy16、sy42、sy44、sy55四条引物中表现出三条带；‘CreamDelight’在sy16、sy32、sy44、sy45、sy55等五条引物中也表现出了三条带；‘Sunshine’在sy45、sy55两条引物中表现出了四条带。由此可以推测，‘Halcyon’‘CreamDelight’‘HenryBockstoce’和‘Sunshine’至少为三倍体或四倍体品种。引物sy45和sy55在‘Halcyon’‘HenryBockstoce’‘CreamDelight’‘Sunshine’4个多倍体品种上均表现出特征谱带，表明这两个引物多态性丰富的同时，特征谱带也多，可考虑将这两个多态性引物在构建指纹图谱、进行品种鉴定时进行优先应用。最终所绘制的图谱能够将所有被试品种(种)完全区分开来。

表3 特征引物的遗传多样性参数

表4 芍药新种质的指纹代码

续(表4)

3 结论与讨论

SSR标记的指纹图谱在亲缘关系、品种及倍性鉴定等方面都具有较为广泛的应用[23-25]。目前，在芍药属内开展的相关工作还不够，仅朱红霞[20]利用AFLP反应体系绘制了5个牡丹品种和6个芍药品种的指纹图，但遗憾的是，由于供试个体较少，研究结果很难真正反映芍药、牡丹之间的遗传背景，制约了后续相关研究的推进。本试验以欧美引进的观赏芍药新种质为材料，在引种的过程中，经常会遇到“同物异名”或者两个品种表型观赏性状非常相似、无法确定其真实身份的情况。这些情况说明了，在植物中开展从表型到DNA分子水平的多方位的种质研究和鉴定工作不仅是可能的，也是基于实际研究应用的需要。其中，通过开发分子标记，构建指纹图谱是一条有效的途径。

试验通过获得15个SSR位点上的遗传多样性信息并根据PIC多态性含量和Shannon遗传多样性指数大小信息，从15对候选引物中筛选10对特征引物，通过采用数字与字母结合排序的方法进行DNA指纹图谱的构建，开创了运用新的可靠方法构建芍药指纹图谱进行种质鉴定和倍性分析的先例，突破了表型进行品种分类鉴定的瓶颈，为DNA指纹技术应用于芍药种质鉴定奠定了应用基础，为观赏芍药进行良种检测以及保护育种者权益提供了一个有效的辅助分析手段。

由于开发标记的数目有限，同时也受到检测技术的限制，开发SSR引物也存在一定的难度，本试验提供的指纹图谱是建立在10个特征引物的基础之上的，引物个数毕竟太少，仅能体现部分特征。同时，构建的指纹图谱主要以DNA的多态性为主，缺少表型形态数据。而且，一般品种倍性的确认主要是靠核型分析及染色体数目的分析，仅从分子水平上判断其倍性证据不足，单纯的指纹图谱仅能作为判断其倍性的一个辅助分析手段。为了丰富该指纹图谱的信息，非常有必要加大试验投入，不断增加SSR位点数目及群体样本个数，增加标记的方法和种类，加快各种新型标记方法(EST-SSR、cpSSR、nSSR、SRAP)的探索和应用，提高指纹图谱的可靠性，不断完善芍药指纹图谱系统。

致谢：感谢花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室(北京林业大学)为本试验提供部分试验条件。

[1] 汪菊渊.芍药史话[J].世界农业,1984(5):52-54.

[2] 李嘉珏.中国牡丹与芍药[M]．北京:中国林业出版社,1999:29-67.

[3] 于晓南,苑庆磊,宋焕芝.中西方芍药栽培应用简史及花文化比较研究[J].中国园林,2011,27(6):77-81.

[4] 于晓南，苑庆磊，郝丽红.芍药作为中国爱情花之史考[J].北京林业大学学报：社会科学版，2014,13(2):36-31.

[5] 郭先锋,王莲英.观赏芍药应用研究的进展[J].山西农业大学学报：自然科学版，2004,24(1):85-88.

[6] 秦魁杰.芍药[M].北京:中国林业出版社,2004：2-19.

[7]Wangqi，ChengTangren，YuXiaonan，etal.Physiologicalandbiochemicalresponsesofsixherbaceouspeonycultivarstocoldstress[J].SouthAfricanJournalofBotany，2014，94：140-148.

[8] 匡猛,杨伟华,许红霞,等.中国棉花主栽品种DNA指纹图谱构建及SSR标记遗传多样性分析[J].中国农业科学,2011,44(1):20-27.

[9] 于晓南,季丽静,王琪.芍药属植物分子水平遗传多样性研究进展[J].北京林业大学学报,2012,34(3):130-136.

Constructing SSR Fingerprinting for Introduced New Germplasm ofPaeoniaL.

Zhang Jianjun(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China); Ji Lijing(National Engineering Research Center for Floriculture); Liu Zhonghe, Zhou Mingjie, Wang Yali(Beijing Jingshan Park); Yu Xiaonan(Beijing Forestry University)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(3)：70-74.

New germplasms;PaeoniaL.; SSR; Primer; Fingerprinting; Identification of cultivars

1)中央高校基本科研业务费专项资金(YX2014-20)、国家自然科学基金项目(31400591)。

张建军，男，1990年1月生，北京林业大学园林学院，硕士研究生。E-mail：zhang727jianjun@126.com。

于晓南，北京林业大学园林学院，教授。E-mail：yuxiaonan626@126.com。

2014年9月8日。

S682.1+2; Q343

责任编辑：任 俐。