基于流式细胞术诊断结核感染的研究进展

吴 凡，孙 林，张晓明，焦新安

基于流式细胞术诊断结核感染的研究进展

吴 凡1,2，孙 林1，张晓明2，焦新安1

结核病是危害人类健康的一种传染病，快速诊断与合理治疗是控制结核病的关键，然而对于潜伏性结核感染仍缺少诊断的金标准。目前，结核菌素皮试以及IFN-γ释放试验被视为诊断是否感染结核的有效方法，它们通过间接检测受试者对结核分枝杆菌的细胞免疫反应做出评判，但这两种方法均存在缺陷，也无法明确区分潜伏性感染和活动性结核。流式细胞术作为一项高新技术已经在医学临床领域得到广泛应用。近年来，流式细胞术检测胞内细胞因子技术在结核感染的诊断及疗效评价等方面取得了一定进展。本文对应用流式细胞术进行结核感染诊断的进展进行综述。

结核；诊断；γ-干扰素；流式细胞术

结核病至今仍是严重危害人类健康的全球性疾病，根据世界卫生组织统计，每年约有800多万新增病例，150多万人死于该病[1]。流行病学模型表明只有实行有效的疫苗政策、对结核感染者以及发病者进行准确诊断和高效治疗，才有望彻底消除结核病[2]。结核分枝杆菌是一种细胞内缓慢生长的致病性微生物，也是人类结核病的病原体，感染初期，大多数人的天然防御机制会起到保护宿主清除病原体的作用，但作为胞内寄生菌，结核分枝杆菌往往可以借助复杂的逃逸机制来逃脱巨噬细胞的杀伤并在细胞内长期存在。人们通常将那些没有表现临床症状的潜伏感染者视作不具有传染威胁，然而潜伏感染者仍有可能发展成活动性患者，所以对潜伏感染者的诊断治疗是有效降低发病风险、控制结核的关键所在。结核潜伏感染者并不表现出临床症状，细菌呈现休眠状态，所以对于潜伏感染的诊断难度较大。近年发现，由于人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)并发、与结核病人亲密接触或者药物治疗导致免疫下降等原因，潜伏感染者发展成结核病人的风险不断提高，这就对结核病的早期诊断提出了更高要求。

目前用于结核病诊断的方法主要有胸部X光摄片、细菌培养、结核菌素皮试(tuberculin skin test, TST)和IFN-γ释放试验(interferon-γ release assays, IGRAs)。传统的检测方法周期长、检出率低、漏诊率高，导致结核菌继续传播和病人治疗延误。TST和IGRAs以宿主发生的细胞免疫反应作为间接诊断的标志，却无法区分潜伏感染和活动性结核病，也尚不能判定结核感染的具体阶段，对于免疫缺陷的病人TST和IGRAs检测的敏感性都有所降低[3]。随着流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)在临床检验中的应用与推广，以FCM为基础检测胞内细胞因子的技术手段在结核诊断及疗效评估等方面显现出诱人的前景。

1 FCM检测胞内细胞因子技术

细胞因子即那些可调节细胞和组织存活、生长、分化以及功能的分泌性蛋白，一种细胞因子通常会参与体内多种生物反应，并且在大多情况下协同发挥功能效应。细胞因子在对抗传染性病原体的天然免疫保护中有着重要的作用，是机体主要的细胞免疫防御机制，在不同疾病状态或免疫状态下的T细胞效应通常与细胞因子基因表达和/或分泌的相对比例相关联[4]。早期分析单个细胞分泌细胞因子的方法有酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)和原位杂交等，但均存在费时耗财的劣势[5]，近年来有研究者开始尝试运用FCM分析细胞因子。

FCM是对处于液流中的细胞或其他各种微粒进行多参数快速分析和分选的技术，可以对细胞膜、细胞质中的蛋白、细胞因子、其他各种特异标志以及细胞核中的核酸蛋白进行分析。自20世纪80年代后期，随着流式细胞仪的发展和荧光素标记抗体的开发，FCM已普遍应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、临床检验学等众多领域。FCM能通过细胞内免疫荧光染色，直接检测与细胞因子特异性结合的抗体，快速测定出细胞亚群产生的细胞因子并加以定量分析，同时不会受细胞浓度、受体溶解等因素的影响。其方法是在抗原刺激细胞产生细胞因子时用蛋白转运阻断药物扰乱高尔基体转运系统，使细胞因子在细胞质中积累，再通过固定使细胞保持形态，破膜剂使流动的、完整的细胞膜产生小孔以利于抗体进入细胞，细胞因子抗体穿过细胞膜与胞内细胞因子特异性结合，即可用FCM进行检测。FCM检测胞内细胞因子技术，为抗原刺激后特异性淋巴细胞的功能评估提供了独一无二的平台，有利于揭示免疫系统在疾病发病机理中的作用，同时也为临床早期诊断和治疗提供重要依据。

2 FCM检测胞内细胞因子技术对结核感染的诊断研究

利用FCM检测胞内细胞因子技术(intracellular cytokine flow cytometry,ICC)进行结核感染诊断的原理是：IFN-γ是介导细胞免疫应答的重要细胞因子，被结核分枝杆菌致敏的T淋巴细胞再次受到相关抗原刺激后会释放IFN-γ[6-7]，通过检测分泌IFN-γ的效应T细胞数量，可以判断是否感染结核分枝杆菌。早期分泌抗原靶标6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)由BCG和大多数非结核分枝杆菌中普遍缺失的RD1区域编码[8]，具有较高的特异性，所以常用作结核检测实验的刺激抗原。

3 FCM检测胞内细胞因子技术的应用评估

4 FCM区分活动性结核病和潜伏感染的探索

结核菌素皮试以及IFN-γ释放试验被视为诊断是否感染结核的有效方法,但也无法明确区分潜伏性感染和活动性结核，随着流式细胞术的价值体现，研究者们尝试从中找到一些新的启发。

目前，很多报道提出脂阿拉伯甘露糖(Lipoarabinomanna,LAM)、16 kDa和38 kDa等结核抗原蛋白，在检测结核病患者方面均有较高的敏感性和特异性，展现了较好的应用前景。但目前这些蛋白作为结核特异性抗原用于流式检测的研究并不多，这或许为FCM技术在结核领域的应用提供了新的思路。

结核带给人类的损失是不可估量的，而对于其早期诊断，目前尚无统一的金标准，相比于PPD试验，IGRAs的特异性和敏感性均有明显的提升，但在某些复杂情况下仍无法给出准确的诊断。流式细胞术不仅可以同时检测多种细胞因子，还可以确定产生细胞因子的细胞亚型，是一种相对快速准确定量细胞因子的方法，虽然胞内细胞因子染色技术在结核领域的应用国内尚未普及，随着FCM的广泛应用，很有希望发展成为一种新的结核感染诊断工具，并且在生物学领域有着巨大的潜在价值。

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Tuberculosis diagnosis based on Flow Cytometry

WU Fan1,2,SUN Lin1,ZHANG Xiao-ming2,JIAO Xin-an1

(1.JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis/JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China;2.InstitutPasteurofShanghai,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200031,China)

Tuberculosis (TB) is an infectious disease endangering people’s health around the world, and diagnosis and rational treatment are the key to control TB. However, currently there is no diagnostic golden standard for latent tuberculosis infection (LTBI). The tuberculin skin test and IFN-gamma release analysis are regarded as effective methods for TB diagnosis, which is based on host’s cellular immune response to mycobacterial antigens. But the two methods are not perfect; neither test can make a clear distinction between latent infection and active TB. Flow Cytometry (FCM) has been widely used in the field of clinical medicine. In recent years, substantial advances have been achieved in the fields of TB diagnosis and evaluation of treatment efficacy by using the FCM intracellular cytokine detection technology. In this paper, we will review the latest progress in tuberculosis diagnosis research by using flow cytometry in recent years.

tuberculosis; diagnosis; IFN-γ; flow cytometry

s:Jiao Xin-an, Email:jiao@yzu.edu.cn

国家青年科学基金(31201882)，江苏省高校自然科学基金(12KJB230001)和中国科学院对外合作重点项目资助(No. GJHZ201312)联合资助

焦新安，Email:jiao@yzu.edu.cn

1.扬州大学，江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏省重要动物疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009； 2.中国科学院上海巴斯德研究所，上海 200031

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.014

R378.91

A

1002-2694(2015)10-0963-04

2015-03-30；

2015-08-09

Supported by the National Science Foundation for Young Scientists of China (No. 31201882) , the Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (No. 12KJB230001), and the External Cooperation Program of Chinese Academy of Sciences (No. GJHZ201312).