三七重茬土壤中化感物质的提取及活性研究

母 丹，龙秀丽，郑丽丝，王志远，赵 静*

(1．玉溪师范学院资源环境学院，云南玉溪653100;2．德宏师范高等专科学校，云南芒市678400)

三七(Panax notoginseng(Bruk)F．H．Chen)又名田七，五加科人参属植物，是我国传统的名贵中药材。由于对环境要求的特殊性，三七主要集中分布于云南文山。三七是忌连作作物，一茬后土壤在几年甚至几十年内都不能再栽。其中一个重要的原因就是化感作用。

化感作用是指一个活体植物向环境释放一些化学物质，影响周围植物的生长和发育。这种作用包括促进和抑制两种［1］。现已发现，植物可通过根系分泌、根茬腐解、茎叶淋洗、微生物代谢活动等途径向环境中释放化感物质［2］。Rice［3］把这些物质归为14类，其中最常见的为低分子量有机酸、酚类和萜类化合物［4］。曾有报道表明，三七连作土壤对白菜、萝卜、莴苣的种子和幼苗均有抑制作用。

通过采用不同的萃取剂及方法，对三七重茬土壤中的化感物质进行分离、提纯，并且测定各组分对白菜种子萌发的抑制作用，初步明确三七化感物质活性组分的萃取条件，并且初步明确重茬土壤萃取液对三七病原菌的化感作用。

1 材料与方法

1．1 材料 供试土壤采自云南省文山州大丫口三七种植基地。在连作3年以上的三七地块上采集土样。各地块处于相邻位置，土壤理化性质基本一致。在每个地块采用五点法采集三七根系下方土壤(0～20 cm)，混匀，共采集15分土样。供试白菜种子为市售青岛83-1。供试三七根腐菌(Fusarium solani)、三七疫病菌(Phytophthora cactorum)由云南农业大学植物病理实验室提供。

1．2 方法

1．2．1 超声萃取法。用萃取剂五倍量提取500 g土壤，于超声清洗机中萃取，温度为25℃，频率为160次/min，2 h。旋转蒸发仪浓缩，上XAD－4大孔吸附树脂。用水及25%、50%和100%的萃取剂洗脱，分别收集各个浓度萃取剂的洗脱液，浓缩，定容至50 ml，置于4℃冰箱内备用。

1．2．2 振荡萃取法。用萃取剂五倍量提取500 g土壤，然后25℃、160 r/min振荡24 h。旋转蒸发仪浓缩，上XAD－4大孔吸附树脂。用水及25%、50%和100%的萃取剂洗脱，分别收集各个浓度萃取剂的洗脱液，浓缩，定容至50 ml，置于4℃冰箱内备用。

1．2．3 生物活性检测。将提取物稀释100倍液，加入底部铺有一层滤纸的培养皿中。每皿放30粒预先用浓度0．5%高锰酸钾消毒的白菜种子，恒温培养箱中培养，温度为25℃，湿度为70%，每24 h向各皿中加入2 ml左右蒸馏水以保持湿度。同时，每隔24 h记录一次种子发芽数，以种子刚露芽为准，3 d后测量其根长。同时，以清水培养为阴性对照，以各萃取剂为阳性对照。

1．3 提取物对三七病原菌的化感作用 将提取的母液稀释到100%、50%，经无菌过滤器过滤后，分别将不同浓度的浸提液与熔融状态下的PDA培养基混合后倒入培养皿中。以浸提剂乙酸乙酯的平板为对照(CK1)，以不加任何物质的平板为空白(CK2)。

2 结果与分析

2．1 萃取方法对白菜种子萌发的抑制作用 分别采用2种萃取方法——超声萃取法和振荡萃取法，对三七重茬土壤的化感物质的活性组分进行萃取。由表1可知，4种萃取剂于25℃、160 r/min振荡24 h萃取的活性组分对白菜种子的萌发抑制作用更强，说明该萃取方法能够萃取到土壤中更多的活性组分。

2．2 不同萃取剂对白菜种子萌发、根长的影响 分别用乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、水4种萃取剂采用振荡萃取法对三七重茬土壤的化感物质的活性组分进行萃取。将萃取到的活性组分对白菜种子进行生物活性检测。由表2可知，乙酸乙酯、甲醇、正丁醇3种有机萃取剂萃取到的活性组分对白菜种子的萌发均具有抑制作用，且萃取剂的浓度越高，萃取到的活性组分抑制作用也越强。其中，100%乙酸乙酯萃取组分的抑制作用最强，培养皿中30粒种子均不萌发，萌发率为0;正丁醇居中;甲醇最弱。而水萃取到的物质对种子的萌发没有抑制作用。

2．3 提取物对三七病原菌的化感作用 利用菌落的生长速率法，测定乙酸乙酯萃取液对三七根腐菌、三七疫病病菌的化感作用。由图1、2可知，在作用时间为72 h时，浓度为100%处理的菌落直径小于对照(CK1)和空白(CK2)。这说明乙酸乙酯萃取物质对三七根腐菌和疫病病菌有不同程度的化感抑制作用，且疫病病菌受到的化感作用更强，菌落直径明显小于对照。随着浓度的减弱，抑制作用降低。当浓度为50%时，菌落直径略微高于对照(CK1)和空白(CK2)。

表1 不同萃取方法对白菜种子萌发的抑制作用

表2 不同萃取剂对白菜种子萌发、根长的影响

3 讨论

由于云南文山种植三七历史悠久，且种植面积广泛，三七连作障碍严重影响当地三七种植业的发展。目前，三七连作障碍的发生面积高达总种植面积的15%，每年由此造成的损失达上千万元。连作障碍已成为三七栽培中亟待解决的难题［5］。现在，许多关于三七连作障碍的研究只是着手于病虫害的治理与预防，很少研究其所具有的化感作用。

宋宇加［6］对栽培人参后土壤进行了化感物质的萃取、检测。在经乙酸乙酯萃取的提取液中共鉴定出43种成分，而经甲醇萃取的提取液中只鉴定出7种。这表明乙酸乙酯能萃取到的活性组分更多。而试验中3种萃取剂对白菜种子的萌发均具有抑制作用，且乙酸乙酯的抑制作用最强，萌发率为0。经乙酸乙酯萃取到活性物质为脂肪烷烃类、芳香烃类、酮类、醇类、酸类、酯类。但是，试验中经乙酸乙酯萃取到的物质种类还有待进一步研究。

研究还表明，随着萃取物浓度的降低，对三七病原菌的化感作用呈降低的趋势。这与曹阳［7］试验结果相似，与王树桐［8］等在对番茄灰霉病等具有抗菌活性的植物浸提液的研究结果也是一致的。化感物质通常是多种成分共存的。化感作用是各类化感物质和环境各个因子如土壤、温度、水、营养物质等综合作用的结果，其中可能同时存在拮抗作用和协同作用［9］。

［1］HYDER PW，FERDRIEKSON EL，ESTELL R E，et al．Tnars port of Phenolic compounds from leaf surface of creosotebush and tarbush to soil surface by Preci pitation［J］．Journal of chemical ecology，2002，28(12):2475－2482．

［2］E·L·赖斯．天然化学物质与有害生物的防治［M］．胡敦孝，译．北京:科学出版社，1988:19－28．

［3］RRCE E L．Allelopathy［M］．2nd ed．Orlando:Academic Press，1984．

［4］余叔文．植物间的相互作用:相生相克现象［M］//余叔文．植物生理与分子生物学．北京:科学出版社，1992:376－394．

［5］孙玉琴，韦美丽，陈中坚，等．化感物质对三七种子发芽影响的初步研究［J］．特产研究，2008(3):44－46．

［6］宋宇加．人参根系分泌物及土壤中化感物质的分离与鉴定研究［D］．长春:吉林农业大学，2008．

［7］曹阳．西芹腐根及腐根际区物浸提液对黄瓜枯萎病菌化感作用的研究［D］．呼和浩特:内蒙古农业大学，2009．

［8］王树桐．对番茄灰霉病菌等具抗菌活性的植物浸提物的研究［D］．保定:河北农业大学，2001．

［9］宋丽．大蒜(Alliumsativum L．)鳞茎粗提物对西瓜和黄瓜枯萎病的抑制效应及其机理研究［D］．杨凌:西北农林科技大学，2006．