一株豇豆花内生巨大芽孢杆菌的分离鉴定

熊燕妮，江瑞晶，方 浩，韩 雪，王 丹 (江汉大学生命科学学院，湖北武汉430056)

豇豆俗称角豆，为蝶形花科1年生缠绕草本植物，在我国各地普遍栽培，深受广大消费者的喜爱。内生菌是从表面消毒的植物组织中分离得到的，不使植物的表型特征和功能发生改变的微生物。植物内生菌可在植物体内定殖，从宿主植物中获得养分和稳定的生长环境，不易受外界条件的影响，可长期发挥生物学作用［1－2］。内生菌在漫长地与植物共生进化的过程中已经可以很好地利用植株所提供的条件和植株的生长环境［3］;同时，有不少内生菌对植株本身产生有益的作用，内生菌与植株之间是共存互惠的关系［4］。目前，利用植物内生菌制备基因工程益生菌和基因工程生防菌已成为内生菌的研究热点［5－6］。

笔者从武汉豇豆种植区筛选出豇豆花内生菌(whcfs1)，在豇豆花各花期花瓣中为优势内生菌，可以在28～44℃生长。经染色，鉴定为革兰氏阳性，芽孢杆菌，16S rDNA扩增产物序列分析为巨大芽孢杆菌，可以分解淀粉，在豆荚中并未分离出此菌。该内生芽孢杆菌有望成为豇豆基因工程益生菌、生防菌宿主菌株。

1 材料与方法

1．1 表面消毒处理 用烧杯取豇豆花冲洗表面污垢，移至无菌瓶中。用浓度0．1%升汞振荡浸泡花3～4 min，用无菌水冲洗3～4遍，再用浓度75%酒精振荡浸泡花3～4 min，无菌水冲洗5～6遍。

1．2 内生菌的分离 将表面消毒处理后的花移至无菌研钵中，减碎，加入生理盐水和石英砂，研磨，2 000 r/min离心10 min，取上清涂布于NA培养基平板，取等量最后一次水洗的无菌水作为空白对照。在30℃恒温培养箱中倒置培养48 h。取培养得到的单菌株做平板划线，分离、提纯并且保种。

1．3 革兰氏染色 将菌液移至载玻片烘干、固定，结晶紫染色1 min，用革兰氏碘液进行媒染1 min，酒精脱色，冲净，番红复染2 min，洗净，用油镜镜检。

1．4 芽孢染色 热固定菌液，孔雀绿染色液加热染色4～5 min，番红复染，洗净，用油镜镜检。

1．5 细菌基因组抽提 细菌用沸水煮10 min，3 000 r/min离心10 min，取上清。

1．6 16Sr DNA扩增 采用16SrDNA通用引物为27F，5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1492R，5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

1．7 聚合酶链扩增反应 利用特异性检测引物，对提取的基因组进行PCR。PCR反应参数为:94℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 30 s循环30次，72℃10 min。

1．8 序列分析 16SrDNA测序结果经过Blast在Genebank中搜索相似序列，并且通过多序列对比软件clustal分析，得到该菌种属情况。

1．9 生长温度范围摸索 菌落涂于LB固体平板，在不同温度培养箱中培养，观察菌落生长情况，记录菌落生长情况。

1．10 糖/酸发酵试验 分别接种于糖发酵培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养16 h，另外保留一支不接种的培养基为对照。

1．11 硫化氢产生试验 取柠檬酸铁盐半固体培养基，穿刺接种，置于37℃恒温培养箱，培养24 h，观察。

1．12 V．P试验 接种于葡萄糖蛋白胨培养基中，置于37℃，培养24 h，观察。在培养液中加入浓度40%KOH溶液10～20滴，然后加入等量的α-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃恒温箱中保温15～30 min，观察。

1．13 吲哚试验 接种于蛋白胨水培养液中，置于37℃培养箱，培养24 h，观察。观察时，加入乙醚1 ml，充分振荡，静置待乙醚浮于上层时，沿管内壁慢慢加入吲哚试剂10滴，观察。

1．14 柠檬酸盐利用试验 接种柠檬酸钠斜面，置于37℃，培养24～48 h，观察。

1．15 淀粉水解试验 接种于淀粉培养基涂平板，于37℃恒温箱，培养16 h，观察。

1．16 油脂水解试验 划线于油脂培养基(花生油)上，于37℃恒温箱培养16、24 h，观察。

2 结果与分析

2．1 革兰氏染色 在革兰氏染色后，油镜下可以看到菌体为短杆状(图1)，为革兰氏阳性菌。

1．2 芽孢染色 由图2可知，在视野下可见红色的杆菌和绿色的芽孢，为芽孢杆菌。

2．3 16Sr DNA测序结果 由图3可知，该内生菌为芽孢杆菌。从所构建的16SrDNA基因进化树上来看，它属于巨大芽孢杆菌。

2．4 生理生化试验结果 根据生化试验结果，发现分离得到的芽孢杆菌不能进行糖发酵，不能产H2S，V．P试验和吲哚试验结果为阴性，不能利用柠檬酸，不能分解油脂，但可以分解淀粉。

2．5 菌落生长温度范围 在LB固体培养基中，菌体营养体可在23～49℃温度范围内生长。

3 讨论

植物内生菌的研究是现代农业微生物学的研究热点。由于起步较晚，很多领域还有待研究，目前在豇豆中分离内生菌的报道仍是空白。该试验分离得到一株豇豆花的内生巨大芽孢杆菌。它可以在豇豆花中定殖，在各期花中属于优势菌株，但在豆荚、豆、叶片和根系中没有分离到。该内生菌生长温度范围宽，营养体可在23～49℃温度范围内生长，更适合武汉地区豇豆开花、结荚的夏秋两季。16S rDNA测序结果显示，该内生菌为巨大芽孢杆菌。生理生化试验表明，该菌符合巨大芽孢杆菌的生化特征。研究表明，巨大芽孢杆菌具有解磷固钾的功能，可用于生产有机肥，是植物良好的益生菌菌株［7－8］;此外，分离得到的豇豆花内生芽孢杆菌可在豇豆花中定植生长，同时可作为豇豆基因工程益生菌或基因工程生防菌的理想宿主菌株。

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