乙肝表面抗原实验室检测方法的进展

刘 杨 综述，彭道荣 审校

（西京医院检验科，陕西西安710032）

由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎（以下简称“乙肝”）现已成为潜在威胁人类生命的全球性疾病，据世界卫生组织（WHO）2014年6月更新的数据显示，全球已有2.4亿人患慢性肝炎传染病，其中每年就有78 万人死于由HBV 感染所致的肝衰竭、肝硬化及原发性肝癌等肝脏疾病［1］。1992年，我国正式将乙肝疫苗纳入免疫规划管理，有效降低了易感人群的数量，但由于我国是一个乙肝大国，乙肝病毒携带者的基数过大，防治工作仍然面临着严峻的挑战。目前，针对HBV感染的实验室检测方法多样，因而选择高效率、高质量的检测方法成为乙肝防治工作的重要前提。

乙肝表面抗原（HBsAg）是临床上应用最多的HBV 感染血清检测标志物，它是WHO 公认的判断HBV 感染的关键指标［2］。自1972年第一批HBsAg 检测试剂盒问世至今，HBsAg的实验室检测经历了从定性、半定量到高定量的发展过程，本文就HBsAg的实验室检测和研究进展作以下综述。

1 HBsAg的形成

HBV 属嗜肝DNA 病毒科，为部分双链环状DNA。当HBV 侵入人体后，经过黏附、脱壳，HBV－DNA 可从肝细胞浆内进入细胞核，在此进一步发育完善，使部分双链环状DNA形成共价闭合环状DNA（cccDNA），并以其为模板转录成不同长度的mRNA，mRNA 进一步进行翻译。HBsAg是HBV 病毒的糖化外膜蛋白，由包膜蛋白基因S编码，包括大蛋白（LHBs）、中蛋白（MHBs）以及主蛋白（SHBs）三种类型。HBsAg具有抗原多型性，“a”为共同抗原决定簇，亚型决定簇“d”和“y”，“w”和“r”因互相排斥而组合成不同的亚型。乙肝患者血清中出现的HBsAg除了来自具有感染性的成熟的乙肝病毒颗粒外，还来自非感染性的病毒颗粒：球状及杆状。虽然非感染颗粒不含DNA，但其分泌量远大于前者。由于HBsAg不仅可来自cccDNA 的转录翻译，也可来自整合入宿主细胞的HBVDNA，因此它能更好地反映HBV 的转录活性和患者的感染状态［3－4］。

2 HBsAg的实验室检测

HBsAg在人体感染HBV 1周后，大多数为6周后即可在体内出现［5］。目前，我国针对乙型肝炎开展的实验室检查项目繁多，包括蛋白质水平的免疫学检测和核酸水平的分子生物学检测。临床上常用于HBsAg的免疫学检测方法有胶体金免疫层析法（GICA）、酶联免疫吸附法（ELISA）、微粒子酶免疫分析法（MEIA）、化学发光免疫分析法（CLIA）等。

2.1 GICA 免疫层析法是九十年代兴起的一种基于免疫胶体金技术的快速诊断技术，GICA 亦称金标法，是利用胶体金显色的特点结合免疫层析法，诊断特异性的待测物而发展起来的［6］。由于该方法简便快捷，实验仅需一步即可完成，而被各大小医院广泛应用。但是，由于金标法检测HBsAg还没有一个卫生行业标准，临床上对该方法的评价参差不齐。

目前，大量报道显示金标法检测HBsAg特异性高，有一定的检出率，但该方法检测的灵敏度低于临床上常用的其他方法。根据上海市临检中心2009年10月第二次室间评估汇报结果分析，采用金标法检测HBsAg 的实验室不合格率非常高，全市6家室间质评未通过的实验室均是采用了金标法。再进一步对该方法进行性能评估发现，其检测灵敏度仅为4IU／mL，而非市面上大多数试剂说明书中描述的2IU／mL（1IU＝0.5ng）［7］，这与孙宗立等［8］的报道一致。但也有报道显示该方法检测灵敏度可达2IU／mL［9］。此外，金标法对灰区标本的检测存在较大缺陷，谢云等［10］在其研究中指出，经过金标法初筛后的血液样本，分别用进口、国产两种HBsAg ELISA 法试剂盒检测，对在灰区（S／CO 值大于或等于0.5）且确定为阳性的152份标本，再次用金标法检测，阳性结果仅为35份，符合率为23%，其检测结果与两种ELISA 试剂检测结果比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 ELISA ELISA 是在放射免疫分析的基础上发展起来的固相酶联免疫测定方法，它先通过化学反应将待测物与酶连接，再通过免疫反应使待测物可与固相载体上的相应抗原（抗体）结合，加入底物后，酶与底物产生颜色反应，根据其颜色深浅来判读欲测的抗原（抗体）水平。常用于定性或半定量检测。该方法灵敏度高，特异性强，无放射性污染，检测成本较低，是目前临床实验室检测HBsAg最常用的方法，但该方法操作繁琐，耗时长，不确定因素较多，易造成孔间的交叉污染。

ELISA 已是临床上运用较成熟的检测方法。我国市面上主要存在进口和国产两类HBsAg ELISA 法试剂盒，国内试剂盒的检测品质虽越来越高，但与进口试剂相比仍有差距，而且国产厂家试剂间比较也存在差异［11］。在孙文利等［12］的报道中，将国产与进口的HBsAg ELISA 法试剂盒质量进行比较，国产与进口ELISA 试剂的灵敏度分别为86%和100%，特异度分别为100%和96%，约登指数分别为0.86和0.96，两试剂的重复符合率均为100%，试剂的灵敏度以进口试剂盒较好，但特异性比国产试剂差。此外，实际工作中，当HBsAg浓度低或基因变异时，可出现检测灰区。据陈善华等［13］报道，用电化学发光法和荧光定量PCR 法，对两种国产HBsAg ELISA试剂盒检测结果为灰区组的106 例标本（0.6≤S／CO＜1）及100份阴性组样本（S／CO＜0.3）进行复检发现，灰区组中电化学发光法检测阳性12例，HBV－DNA 检测阳性16例，与HBsAg阴性组差异均有统计学意义（P＜0.05），说明ELISA 法检测HBsAg“灰区”标本时存在一定数量的阳性结果，对这类样本有研究认为应进一步做抗体中和确认试验以确保检测结果的准确性和真实性［14］。

2.3 CLIA CLIA 是将化学发光测定技术与免疫反应相结合的一种分析方法，它既有化学发光测定技术的高灵敏度，又兼具免疫反应的高特异性，因此临床上应用广泛。与上述两种方法不同的是，由于该方法线性范围宽，临床上常用作HBsAg的全定量检测，为监测乙肝患者抗病毒治疗疗效提供帮助。自1990年，发现HBsAg“a”表位G145R 突变株以来，各种有临床意义的“a”表位变异的HBsAg变异株屡见不鲜，这样使得当前的HBsAg试剂检测能力下降，对检测试剂的灵敏度提出了更高要求［15］。目前，CLIA 由于其较高的检测灵敏度和广谱性，现已成为国际上主流的HBsAg全定量的检测方法。它包括两代试剂：第一代为美国雅培公司的化学发光微粒子免疫检测（CMIA）试剂盒，第二代为德国罗氏诊断公司推出的电化学发光免疫检测（ECLI）试剂盒。这两种试剂盒均可溯源至WHO标准品，定量检测结果以国际单位IU／mL 的形式表示，1IU／mL约等于1～10ng／mL 的HBsAg，两者之间也有很好相关性［16］。

2.3.1 化学发光微粒子免疫分析法 ARCHITECT HBsAg是利用CMIA 技术的弹性检测，通过两步免疫测定法，定量检测人血清或血浆中的HBsAg。第一步，将标本和Anti－HBs包被的顺磁微粒子合并。标本中存在的HBsAg便结合到Anti－HBs包被的顺磁微粒子。洗涤后，在第二步加入吖啶酯标记Anti－HBs的结合物。再次洗涤之后，加入预触发液和触发液，复合物中的吖啶酯被氧化发光，发光强度用相对发光值（RLU）表示，标本中的HBsAg 含量与光学系统所检测到的RLU 呈正比。

化学发光微粒子免疫分析法因其具有很好的特异性、较高的灵敏度和重复性被认为是免疫检测的金标准［17］。在马连学等［18］的报道中，CMIA 法所测得的113例阳性标本中，经确认试验阳性数为103例，确认阳性率91.2%，ELISA 法阳性率为83.2%，两种方法检测结果差异有统计学意义（P＜0.05）。CMIA 法假阳性标本表面抗原定量值在0.05～0.12IU／mL之间，提示对于弱阳性结果需要做确认试验以保证试验正确性。李美忠等［19］也就CMIA 法测定HBsAg的临床应用做了评价，Architect iR2000免疫发光系统及配套试剂检测灵敏度可达0.2μg／L，而ELISA 法仅能达到0.5μg／L。重复性试验HBsAg低值和高值质控品变异系数（CV）分别为5.22%及5.46%，线性试验在0～250IU／mL 范围内结果可靠。ARCHITECT 化学发光微粒子免疫分析法作为第一代HBsAg化学发光检测试剂盒，其原倍的检测范围最高为250IU／mL，不能满足大部分乙肝患者的需求，若进行高值标本的检测需要进一步手工稀释，因此大大降低了实验室检测效率。

2.3.2 电化学发光免疫分析法 Roche Elecsys是采用单克隆和多克隆HBs抗体（小鼠和羊）测定HBsAg。两种生物素化的抗HBsAg单克隆抗与钌复合物标记的一种抗HBsAg单克隆抗体和多克隆抗体混合物与待测抗原反应，形成抗原－抗体复合物，复合物可进一步与加入的链霉亲和素包被的微粒结合，微粒通过电磁吸附在电极板上，在电压的作用下，使复合物化学发光，光学系统检测的发光值强度与待测抗原浓度呈正比。

与第一代CLIA 检测HBsAg试剂盒比较，较多报道都显示两者检测结果的相关性较好［21］，但Roche Elecsys具有更多优越性，首先表现在对突变株的检出率上。俞莹卿［21］在对第二代化学发光试剂检测HBsAg进行多中心评估时，分别用一代、二代化学发光检测试剂盒及其他酶联免疫试剂盒对13株重组乙肝病毒血清突变株和3株天然变异株进行检测，结果显示罗氏ECL试剂的检出率为98.1%，雅培的CLMI检出率为87.6%，而科华的ELISA 试剂盒检出率仅为19.3%，表示罗氏的二代试剂对突变株敏感性优于一代的雅培试剂，且两代化学发光检测试剂盒对突变株的检出能力大大优于ELISA 试剂，提高了实验室的检出率，降低假阴性样本。其次，罗氏ECL 试剂检测线性宽，上机强制400 倍稀释情况下检测范围可达52 000IU／mL，可满足临床大部分患者的检测需求，提高实验室检测效率。此外，何宗忠等［22］在电化学发光测定低浓度HBsAg的研究中报道，与ELISA 相比，两方法检测高浓度HBsAg的总符合率高达98.88%，一致性很好，但对低浓度HBsAg样本的检测符合率仅72.49%，说明两种方法对低浓度HBsAg检测一致性较差，差异有统计学意义（χ2＝7.592，P＝0.008）。

3 小结与展望

当HBV 感染人体后，机体免疫力会不同程度的对病毒做出免疫应答及清除，使得病毒的感染出现不同的结果，如急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、乙肝病毒携带者等。HBsAg不仅是判断HBV 感染的指标，也是临床上检测抗病毒治疗疗效的工具。近些年由于乙肝疫苗及抗病毒药物的广泛应用，加速了HBsAg变异株的出现。如研究已证实的G145R、131I、C138Y等表位的突变，可能会导致目前已有的HBsAg试剂检测能力下降，从而对临床诊断和血液筛查带来威胁［23－24］，因此，高灵敏度、高特异度的HBsAg 检测试剂的应用在临床上至关重要。实验室应对各检测方法的性能进行评估和比对，根据检测目的选择最优方法，从而对临床HBV 感染者的筛查、诊断及治疗提供最有效的帮助。

［1］World Health Organization.Hepatitis B［EB／OL］.［2014－12－20］.http：／／www.who.int／mediacentre／factsheets／fs204／en／.

［2］Seeger C，Mason WS.Hepatitis B virus biology［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2000，64（1）：51－68.

［3］田晓晨，闻玉梅.剖析乙肝病毒的包膜——乙肝表面抗原的生物学功能及其致病机制［J］.自然杂志，2010，32（6）：314－318.

［4］胡晨波，陆培瑜，陈晓蓉.HBsAg定量在慢性乙型肝炎自然史及干扰素治疗中的临床意义［J］.肝脏，2014，19（1）：74－76.

［5］马明，刘新钰，张汉荣，等.YMDD 变异后继续使用及停用拉米夫定的临床转归分析［J］.中华传染病杂志，2005，23（2）：132－134.

［6］Valkirs GE，Barton R.ImmunoConcentration－a new format for solid－phase immunoassays［J］.Clin Chem，1985，31（9）：1427－1431.

［7］朱宇清.乙型肝炎表面抗原胶体金免疫层析法血清快速测定的性能评估［D］.上海：复旦大学，2012.

［8］孙宗立，任利群，谷雷，等.胶体金免疫层析法检测乙型肝炎病毒表面抗原的应用评估［J］.医药论坛杂志，2007，28（15）：46－47.

［9］周迎春，陈辉，关平，等.3种方法测定低浓度乙型肝炎病毒表面抗原效果评价［J］.检验医学与临床，2007，4（11）：1070－1071.

［10］谢云，冯惟萍，李国英，等.胶体金法、ELISA 法检测HBsAg在献血者初筛中的作用［J］.甘肃医药，2014，33（2）：103－104.

［11］贾志远.ELISA 检测试剂的评价方法［D］.北京：中国协和医科大学，2007.

［12］孙文利，张献清，穆士杰，等.国产与进口HBsAg ELISA 试剂盒的质量比较［J］.中国生物制品学杂志，2006，19（1）：71－72.

［13］陈善华，朱丽莉，李浩，等.ELISA 方法检测HBsAg设置灰区的必要性探讨［J］.中国输血杂志，2013，26（10）：1013－1014.

［14］王强，李文郎，黄国清，等.确认试验在乙肝表面抗原弱阳性样本判定中的应用［J］.国际检验医学杂志，2013，34（5）：619－620.

［15］肖勤，林金明.化学发光免疫分析新进展［J］.分析试验室，2011，30（1）：111－122.

［16］Wursthorn K，Jaroszewicz J，Zacher BJ，et al.Correlation between the Elecsys HBsAg II assay and the Architect assay for the quantification of hepatitis B surface antigen（HBsAg）in the serum［J］.J Clin Virol，2011，50（4）：292－296.

［17］刘冀珑，乔惠理，邓泽沛.化学发光免疫技术［J］.化学通报，2000（7）：49－53.

［18］马连学，李艳菊，魏巍.化学发光微粒免疫法和酶联免疫吸附法检测乙肝表面抗原的结果对比分析［J］.中国实用医药，2014，3（9）：89－90.

［19］李美忠，姜庆波.化学发光微粒子免疫法测定乙型肝炎表面抗原的临床应用评价［J］.实用医技杂志，2010，17（4）：343－344.

［20］Sonneveld MJ，Rijckborst V，Boucher CA，et al.A comparison of two assays for quantification of Hepatitis B surface Antigen in patients with chronic hepatitis B［J］.J Clin Virol，2011，51（3）：175－178.

［21］俞莹卿.第二代化学发光试剂检测乙肝表面抗原的多中心评估［D］.上海：复旦大学，2011.

［22］何宗忠，裘宇容，魏东，等.电化学发光测定低浓度乙肝病毒表面抗原的临床意义［J］.中国实验诊断学，2013，17（11）：2056－2058.

［23］Hsu HY，Chang MH，Ni YH，et al.Survey of hepatitis B surface variant infection in children 15years after a nationwide vaccination programme in Taiwan［J］.Gut，2004，53（10）：1499－1503.

［24］Hollinger FB.Hepatitis B virus genetic diversity and its impact on diagnostic assays［J］.J Viral Hepat，2007，14（Suppl 1）：11－15.