基于几丁质酶基因序列分析鉴定兔源须癣毛癣菌

刘 月，刘彦威，白福娟，刘 娜，刘 伯

(河北工程大学农学院动物医学重点实验室，邯郸 056021)

基于几丁质酶基因序列分析鉴定兔源须癣毛癣菌

刘 月，刘彦威*，白福娟，刘 娜，刘 伯

(河北工程大学农学院动物医学重点实验室，邯郸 056021)

利用几丁质酶基因(CHS1)序列分析和形态学方法对兔源须癣毛癣菌分离株(31株)进行鉴定和分型。从患兔采集病料，在沙保弱培养基进行分离培养，观察菌落和菌丝、孢子的形态及尿素酶、毛发穿孔等生理试验表现；提取病料和分离株DNA，扩增目的基因，通过序列分析，结合形态学方法对分离株进行鉴定，根据分离株序列同源性差异进行基因分型。结果显示，分离株的菌落多数为颗粒型和粉末型，占87.09%(27/31)，背面有黄褐色素沉着，有大量葡萄状小分生孢子、螺旋菌丝、梳状菌丝及棒状大分生孢子，尿素酶试验和毛发穿孔试验阳性；CHS1序列比对显示分离菌株与须癣毛癣菌复合体的指间须癣毛癣菌有99.2%～95.4%相似性。根据CHS1序列比对结果，结合分离株的形态学特征，将该菌株鉴定为亲动物指间须癣毛癣菌。基于CHS1序列同源性差异，将分离株分成5种基因类型，其中Ⅰ型和Ⅱ型是优势菌株，占54.84%(17/31)，提示CHS1序列分析可以用于须癣毛癣菌的鉴定和基因分型。

须癣毛癣菌；几丁质酶基因；序列；鉴定；分型

须癣毛癣菌是引起皮肤真菌病的常见病原真菌，是兔等动物的第一大病原真菌，人的第二大病原真菌[1-2]。随着养兔业的发展，须癣毛癣菌病的发生有不断增加的趋势，这不仅给养兔造成严重的经济损失，更重要的是当兔作为宠物饲养，可以通过与患兔直接和间接接触传染人，给公共卫生带来隐患[3]。传统皮肤真菌检查包括病料的直接检查和分离培养，病料直接显微检查可区分皮肤和非皮肤真菌感染，但有时会出现假阴性，因此，通常确诊有赖于病原真菌分离培养。由于皮肤真菌生长慢，分离到纯化需2～3周[4-5]，这显然不能满足临床的需求，建立快速、准确的鉴定与诊断方法是目前亟待研究的课题。随着分子生物学技术的发展，通过分子标记序列分析进行真菌鉴别与分类，其结果更加准确可靠[4，6]。

皮肤真菌主要涉及毛癣菌属(Trichophyton)、小孢子菌属(Microsporum)和表皮癣菌属(Epidermophyton)，在临床上这些皮肤真菌均可引起脱毛、皮肤红肿及瘙痒等症状，且常常是多种皮肤真菌继发和并发感染。然而，不同皮肤真菌所采取防疫和治疗措施是不同的，因此，对皮肤真菌种类确定至关重要[6]。目前，在皮肤真菌系统发育分析和鉴定中，常用的分子标记是内转录间(internal transcribed spacer，ITS)区，在国外几丁质酶基因(chitin synthase genes，CHS)序列系统发育分析已用于皮肤真菌的鉴定[7-8]，而国内，用CHS作分子标记鉴定皮肤真菌报道很少，特别是用于鉴定动物皮肤真菌还未见报道，鉴于此，本试验直接从患兔采取病料，对皮肤真菌进行分离培养，通过CHS1序列系统发育分析，对分离的皮肤真菌进行鉴定和分型，旨在为皮肤真菌防治提供有价值的资料。

1 材料与方法

1.1 病料的采集

取疑似患皮肤真菌病的兔，病灶用75%酒精消毒，用无菌手术刀在病变和健康皮肤交界处，轻轻刮去皮屑或被毛，放置在灭菌的平皿中。每个兔的病料分成2份，一份用于皮肤真菌的分离培养，一份用于直接检查。从13个兔场(其中邯郸6个、保定4个、石家庄3个)共采集病料146份。

1.2 病原真菌分离培养和观察

将采集的病料(皮屑、被毛)直接涂布在沙保弱培养基(含0.5%氯霉素)，27 ℃培养7 d。挑取菌落接种在土豆琼脂培养基进行纯化培养，27 ℃培养10 d，每天观察菌落形态、颜色并做记录。取干净的载玻片，滴一滴棉兰染液，用胶带粘的一面，轻轻按在纯化的菌落，放置在滴染液载玻片染色，在显微镜下观察菌丝和孢子形态。

1.3 生理学试验

1.3.1 尿素酶试验 选取分离菌株，接种于尿素培养基(蛋白胨0.1 g、氯化钠0.5 g、磷酸二氢钾0.2 g、尿素0.2 g、葡萄糖0.01 g、蒸馏水100 mL、0.2%酚红0.4 mL)，每日观察尿素培养基的颜色变化，用红毛癣菌(校附属医院惠赠)作为阴性对照，用本实验室保藏的须癣毛癣菌株作为阳性对照。

1.3.2 毛发穿孔试验 用消毒吸管吸取10%酵母浸膏，加入蒸馏水平皿中，每平皿2～3滴，每平皿分别加入数根灭菌的兔毛，接种分离菌于平皿中。27 ℃培养4 d，以后每隔1 d将兔毛用消毒镊子夹出，分置于载玻片上，加乳酸酚棉兰染液，镜下观察，持续2个月。用红毛癣菌作为阴性对照，用本实验室保藏须癣毛癣菌株作为阳性对照。

1.4 DNA提取

DNA提取按试剂盒说明进行。在提取前，对体积较大病料，切成小的碎片，研碎。放在液氮中研磨，以下按试剂盒(真菌基因组DNA提取试剂盒，北京索莱宝科技有限公司)方法进行。对于培养菌株，震荡培养后，可直接挑取适量的菌丝，其DNA提取方法与病料相同。

1.5 目的基因扩增

从GenBank调取CHS1基因(NW003315086)，采用Primer express 2.0软件设计一对特异性引物，上游引物为CHSF(5′-GAAGCCTGGAAGAA-GATTGTCG-3′，核苷酸937—959)，下游引物为CHSS (5′-CCTTGATTTCACCGCAGGCAC-3′，核苷酸1 350—1 371)进行真菌CHS1扩增，其片段为435 bp。引物由华大基因合成。

PCR反应体系：Mix 12.5 μL，引物各1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，加ddH2O补足25 μL；PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃50 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，于4 ℃终止反应，保存备用。取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳，观察结果。

1.6 PCR产物的克隆和测序

PCR反应液回收，pMD18-T载体连接。用热激法转化DH5α，用含有50 mg·L-1的氨苄青霉素LB平板(预先涂Xgal和IPTG)筛选阳性克隆并进行双酶切与验证。酶切体系(10 μL)组成：Buffer K 1 μL，PstⅠ 0.5 μL，BamHⅠ0.5 μL，含插入片段的质粒DNA 2 μL，ddH2O 6 μL，37 ℃下酶切1 h。序列测定由上海生物工程技术服务公司完成。

1.7 目的片段序列的分析

将待测菌CHS1序列与GenBank中的核酸数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast)进行BLAST比对分析，找出与其相似性最高的菌株。将得到的CHS1序列用ClustalX1.83进行多重序列比对后，用系统发育软件MEGA4.1，采用最大似然法构建基于CHS1序列分析的系统发育树，并对所构建的系统发育树进行自举分析，估算其内分支的Bootstrap值，进而确定其系统发育关系。

2 结 果

2.1 菌落形态和菌丝、孢子的显微观察

在采集146份病料，分离纯化31株真菌，分离率为21.23%(31/146)。从病料分离的菌株经纯化培养后，根据菌落的形态可分为3种(表1)。1)颗粒型占58.06%(18/31)，菌落呈颗粒状，表面不平，边缘不整齐，背面黄褐色(图1A、B)，在显微镜下有呈葡萄状小分生孢子，大分生孢子为棒状有5～7分隔，数量较多(图1E)。2)粉末型占29.04%(9/31)，菌落为粉末状，表面平滑，背面黄褐色，小分生孢子为圆形或卵圆形，大分生孢子较少。3)绒毛型占12.90%(4/31)，菌落表面有皱褶，边缘不齐，背面黄褐色，大分生孢子最少，但螺旋菌丝(图1C)和梳状菌丝(图1D)较多。

2.2 生理试验

尿素酶试验：分离菌株和阳性对照组菌株，接种在尿素培养基3 d左右就由黄色变成粉红色(图2A)，而阴性对照，接种红色毛癣菌，直到10 d培养基颜色也没有变红。

毛发穿孔试验：将待检菌接种在培养基上，25 d左右，在分离菌株和阳性对照菌株可观察到毛发穿孔样变化，即在毛干有不规则的凹陷及楔状穿孔(图2B)，而阴性对照组，红毛癣菌未发现毛发穿孔现象。

2.3 目的基因扩增结果

利用特异引物CHSF和CHSS，对分离株和直接病料提取的DNA进行CHS1扩增，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，从电泳图(图3)可看出，在430 bp处见到扩增条带，与预测的CHS1序列片段大小范围一致。

2.4CHS1基因序列分析

利用ClustalX1.83软件在线构建了分离株(31株)和须癣毛癣菌复合体(Trichophytonmentagrophytescomplex)、小孢子菌属(Microsporumincurvatum)和表皮癣菌属(Epidermophytonfloccosum)CHS1基因进化树，通过序列比对，共分成3个组(图4)，即Ⅰ组为小孢子菌属，Ⅱ组为表皮癣菌属，Ⅲ组为分离株和须癣毛癣菌复合体。不同分离株序列相似性为95.2%～100%，与Microsporumincurvatum、Epidermophytonfloccosum相似性分别为79.4%～88.8%和85.5%～88.6%。分离株与须癣毛癣菌复合体T.interdigitale、A.vanbreuseghemii、A.benhamiae和A.simii相似性分别为99.2%～95.4%、91.6～95.2%%、91.6%～93.9%和89.1%～92.2%，提示分离株CHS1与T.interdigitale相似性(99.2%～95.4%)最高，即分离株为指间须癣毛癣菌(T.interdigitale)。

表1 分离株菌落形态和显微特征

Table 1 Colony morphology and microscopic features for isolates

表型Phenotype株数StainsNumber分离株Isolates来源Origin小分生孢子Microconidia大分生孢子Macrocondia螺旋菌丝Spiralhypae梳状菌丝Pectinafehypae颗粒型Granular18B1、B2、B4、B5、B6、B7、B8、B9保定++++++++S3、S4、S6、S7、S10、S11、S12、S14邯郸G2、A1石家庄粉末型Powder9B3保定+++++++S1、S2、S5、S9、S13邯郸F2、F3、F1石家庄绒毛型Downy4B10保定+++--/++++++S8邯郸A2、G1石家庄

A.颗粒状菌落(正面)；B.颗粒状菌落(背面)；C.螺旋状菌丝(400×)；D.梳状菌丝(400×)；E.大、小分生孢子(400×)A.Granular colony (front)；B.Granular colony (reverse)； C.Spiral hyphae(400×)；D.Pectinafe hyphe(400×)E.Macrospore and microspore (400×)图1 须癣毛癣菌菌落和菌丝形态Fig.1 Morphology of colony and mycelial in T.mentagrophytes

A.尿素酶试验；B.兔毛楔状穿孔(1 000×) A.Urease test；B.Wedge shape perforation in rabbit′s hair (1 000×)图2 生理试验Fig.2 Physiological test

M.DNA相对分子质量标准；F1～S11.分离株M.DL2000 DNA marker；F1-S11.Isolates图3 CHS1扩增结果Fig.3 Result of CHS1 amplification

2.5 分离株CHS1序列比较及分型

从河北兔场共分离须癣毛癣菌31株，其中邯郸地区14株(S1～S14)、保定地区10株 (B1～B10)和石家庄地区7株(F1～F3、G1～G2、A1～A2)(表2)。经CHS1序列比对，根据相似性差异进行分型，菌株B2、B6、B8、B9、S3、S4、S6、S11、S12、G2相似性为100%，提示这些菌株虽然从不同患兔上分离，但其实完全一致，称之Ⅰ型株，占32.26%(10/31)，其表型为颗粒型；同样，菌株F2、F3、S1、S2、S5、S13、B3相似性为100%，称之Ⅱ型株，其表型为粉末状，占22.58%(7/31)；菌株S10、S14、S7、B7相似性为100%，称之Ⅲ型株，其表型为颗粒型，占12.90%(4/31)；菌株A1与B1、菌株B4与B5 、菌株F1与S9相似性分别为100%，称之Ⅳ型株，其表型主要为颗粒型，亦有粉末型；其他菌株A2、B10、S8、G1均为单一株，称之为Ⅴ型，其表型为绒毛型(图5)。

图4 分离菌株CHS1序列与GenBank序列的系统发育树Fig.4 A phylogenetic tree of CHS1 sequence from isolates and GenBank

表2 分离株的分型

Table 2 Subtype of isolates

株型Type兔场Rabbitfarm12345678910111213表型Phenotype百分比/%PercentageⅠ型TypeⅠB2B6B8、B9S3、S4S6S11S12G2颗粒型Granular32．26(10/31)Ⅱ型TypeⅡB3S1、S2S5S13F2、F3粉末型Powder22．58(7/31)Ⅲ型TypeⅢB7S7S10S14颗粒型Granular12．90(4/31)Ⅳ型TypeⅣB1B4B5S9A1F1颗粒/粉末型Granular/Powder19．35(6/31)Ⅴ型TypeⅤB10S8A2G1绒毛型Downy12．90(4/31)

图5 分离株CHS1系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of CHS1 sequence in isolates

2.6 病料PCR和CHS1序列分析

从分离须癣毛癣菌阳性病料中，挑选10份病料直接提取DNA，进行CHS1扩增，经琼脂糖电泳后，其片段大小与分离株一致，通过序列测定和比对，与相应的分离株的序列没有差异。

3 讨 论

3.1 分离株鉴定为亲动物指间须癣毛癣菌

兔皮肤真菌病涉及毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属，共有30余种病原真菌。皮肤真菌不同所采取的预防和控制措施不同，所用治疗药物也有差异，因此，对皮肤真菌进行种和菌株水平的鉴定至关重要[7，9]。本试验选用CHS1作为靶基因，经过序列分析并与相应GenBank基因序列比对，根据同源性不同，很清晰把这三个属皮肤真菌分开。且发现分离株与须癣毛癣菌同源性最高，因此，可以鉴定该皮肤真菌归须癣毛癣菌属。

须癣毛癣菌长久以来被视为一个单一的菌种，但随着交配试验和分子生物学的研究，学者们发现须癣毛癣菌应该被视为一个菌种的复合体，所包括的菌种分属于3种不同有性型菌属，分别是本海姆节皮菌(A.benhamiae)、万博节皮菌(A.vanbreuseghemii)和猴节皮菌(A.simii)，并包含有不同亲宿主性的无性型菌种(如指间须癣毛癣菌、须癣毛癣菌颗粒变种等)[1,6]。采用CHS1序列比对，按相似性不同，本试验发现，与须癣毛癣菌复合体中其他菌株相比，分离株与指间须癣毛癣菌相似性最高(99.2%～95.4%)，因此，该皮肤真菌应属于须癣毛癣菌复合体的指间须癣毛癣菌。这与本实验室用rDNA ITS作为靶基因比对的结果一致(未发表资料)。P.L.Sun等对兔源须癣毛癣菌复合体的8株菌进行了分子系统分析，这些分离株被鉴定为指间须癣毛癣菌[3]，这与本试验结果一致。但Y.Gräser等则认为本海姆节皮菌是兔主要的病原真菌[10]，M.Kawasaki等报道用交配试验从兔分离到本海姆节皮菌[11]，提示不同地区兔须癣毛癣菌复合体种类可能存在差异。

本试验发现在沙保弱培养基上，分离株菌落多数为颗粒型和粉末型，能产生黄褐色素，且随着培养时间的延长，色素增多，颜色加深。尿素酶试验阳性，提示该分离株可分解尿素，产生碱性物质，随着pH升高，使培养基酚酞由无色转变为红色，致使整个培养基呈粉红色。在毛发穿孔试验中，由于分离株能产生分解角质蛋白的酶，因此，这些菌株可以利用角化毛发进行生长繁殖，可在毛干或毛髓中看到菌丝生长，正是这些菌丝生长，破坏了毛干形态结构，使之出现“楔状”损伤，即毛发穿孔试验阳性。这些均符合须癣毛癣菌的特征[1]，从生理学和菌落形态进一步支持了CHS1序列比对的鉴定结果。

指间须癣毛癣菌根据宿主不同分为亲人和亲动物两种[12]。本试验发现分离株菌落为颗粒状和粉末状，在显微镜下较多的大分生孢子和螺旋菌丝，这些均为亲动物形态特征，这些菌株均由兔分离而来，所以该分离株应该为亲动物指间须癣毛癣菌。

3.2 表型颗粒型、粉末型和基因Ⅰ型、Ⅱ型是主要流行株

对须癣毛癣菌菌落形态的分型已有报道，李庆祥等依据菌落的形态，菌丝及大小分生孢子的特征，尿素酶试验和体外毛发穿孔试验，将人源的须癣毛癣菌表型分为羊毛状、紧密状、绒毛状、粉末状和颗粒状，以羊毛状、紧密状、绒毛状居多(占72.22%，26/36)，且发现菌株的表型与致病性及耐药性有关[13]。本试验分离的31株菌，仅发现颗粒状、粉末状和绒毛状3种菌落类型，且以颗粒状和粉末状居多，约占87.09%(27/31)。P.L.Sun等报道兔源指间须癣毛癣菌的表型以颗粒状为主[3]，而E.Fréalle等报道以粉末状为主[14]，人源与兔源分离株菌落表型的差异，可能与宿主不同有关。

E.Fréalle等基于含锰超氧化歧化酶(MnSOD)基因序列比对将41株须癣毛癣菌分成5种基因型[14]，而B.Ninet等用28S rDNA多态位点将67株须癣毛癣菌分成3种基因型[15]，I.Drira等用可变数量串联重复(VNTR)序列为标记将92株指间须癣毛癣菌分成3群[2]。本试验根据CHS1序列差异，将分离指间须癣毛癣菌31株分成5个基因型，其中Ⅰ型(表型为颗粒型)和Ⅱ型(表型为粉末型)从3个地区均能分离到，提示这些基因型的菌株地理分别比较广；另外，这两种类型的菌株，约占流行株54.84%(32.26%+22.58%)，是本地区流行优势菌株，这与表型中以颗粒型和粉末型居多的结果一致。这些均为针对基因型和表型，采取有效措施预防和治疗须癣毛癣菌病提供了有价值的资料。但李金海等用随机扩增多态性DNA的方法，分析了不同表型人源须癣毛癣菌，扩增后其基因型没有差异[16]。方法不同，须癣毛癣菌基因分型结果不一样，导致这种差异的原因可能与菌株的组成以及所用方法的敏感性和选用的标记分子有关。

3.3 病料可直接用于基因序列分析

有关须癣毛癣菌鉴定和诊断，多数报道是从分离培养须癣毛癣菌中提取DNA，然后进行分子生物学的研究，众所周知，须癣毛癣菌生长缓慢，从分离到纯化一般需要2～3周的时间，因此，不利于该病的早鉴定和早诊断，鉴于此，本试验直接从病料提取DNA进行目的基因扩增，经基因比对，与培养菌株没有差异，提示对于须癣毛癣菌的鉴定和诊断可直接采集病料，减少培养环节，明显缩短鉴定时间，为该病的及时诊断奠定基础。

4 结 论

用几丁质酶基因特异引物，扩增目的片段，通过序列比对，根据序列相似性差异，可对常见3个属的皮肤真菌进行鉴定，也能将同种，而宿主不同形成须癣毛癣菌复合体进行区分。基因比对方法敏感、稳定，不易受培养条件的影响。用菌落形态、菌丝显微结构及生理生化特征鉴定方法，虽简单、直观，但易受培养条件的干扰。因此，理想方法是分子生物学与形态学相结合。用基因比对结合形态学方法，将分离株鉴定为亲动物指间须癣毛癣，兔场菌感染率为21.23%。根据菌落的形态特征将分离31株须癣毛癣菌分为颗粒型、粉末型和绒毛型三种表型，其中以颗粒型和粉末型为主。基因比对方法将分离株分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ五种基因型，基因Ⅰ型、Ⅱ型是主要流行株。

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(编辑 白永平)

Identification ofTrichophytonmentagrophytesin Rabbit based on the Chitinase Gene Sequence Analysis

LIU Yue，LIU Yan-wei*，BAI Fu-juan，LIU Na，LIU Bo

(KeyLaboratoryofAnimalMedicine,AgriculturalCollegeofHebeiUniversityofEngineering，Handan056021,China)

It was conducted to identify the gene type of 31Trichophytonmentagrophytesisolated from rabbits.Samples were collected from infected rabbits for cultivation experiments on Sabouraud′s medium.Isolates were identified by morphology，urease test，hair perforation test and DNA analysis，and then subjected to phenotyping analysis byCHS1 gene sequencing.Results showed that 87.09% (27/31) of the colonies were granular- and powder-like with yellow-brown pigmentation deposition.Numerous grape-like microconidia，spiral hyphae，pectinafe mycelium and club-shaped macroconidia were presented in the culture.Urease test and hair perforation test were positive.TheCHS1 sequences of the isolates showed 99.2%-95.4% homology withTrichophytoninterdigitale.The results indicate that the isolates obtained in the present study are most likely zoophilicTrichophytoninterdigitale.Based on theCHS1 gene variations in sequences，the isolates were divided into 5 genotypes.The type Ⅰ and type Ⅱ were the dominant genotypes，which accounted for 54.84% (17/31) of the isolates.These results suggest that analysis ofCHS1 sequences is useful for identification and typing ofTrichophytonmentagrophytes.

Trichophyton mentagrophytes；chitinasegene；sequence；identification；subtype

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.018

2014-12-19

河北省教育厅重点项目(Z02014048)；邯郸市科技局资助项目(1422101047-3)

刘 月(1990-)，男，河北保定人，硕士，主要从事病原真菌的研究，Tel:0310-8573034，E-mail:812094491@qq.com

*通信作者：刘彦威，E-mail:Liuyw.edu@126.com

S852.66

A

0366-6964(2015)08-1417-08