越橘抗寒性研究进展

乌凤章

（大连大学现代农业研究院，辽宁大连116622）

越橘抗寒性研究进展

乌凤章

（大连大学现代农业研究院，辽宁大连116622）

低温是限制越橘栽培区域和影响果实产量的重要环境胁迫因子。近年来，利用基因组学和转录组学方法鉴定许多与越橘抗寒性有关的基因或蛋白，为开发抗寒越橘新品种提供依据。文章从越橘抗寒性特点、内在冰核分布特征、抗寒分子机制及分子标记辅助育种等方面归纳和总结，并预测今后越橘抗寒性研究方向。

越橘；抗寒性；低温锻炼；研究进展

越橘是杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium spp.）多年生灌木性植物，果实花色苷具有抗氧化、清除自由基、抗癌和改善视力等生物活性，具有保健功能[1]。中国栽培越橘起步于20世纪80年代中期，21世纪初开始推广，目前栽培面积达26 000 hm2，发展迅速[2]，已成为我国最具发展潜力的新兴经济树种之一。但我国北方地区经常发生冬季冻害、晚秋及早春霜冻害和生理干旱伤害，降低果实产量，成为制约越橘产业快速发展主要因子之一[3-4]。因此开发适应北方寒冷地区的高抗寒性品种，已成越橘育种重要目标之一。近年来，有关越橘抗寒性研究，尤其是越橘低温锻炼的基因组学和功能基因组学研究取得很大进展。本文对越橘抗寒性特点、内在冰核分布特征、抗寒分子机制及分子标记辅助育种等加以综述，以期为越橘栽培及育种提供参考。

1 越橘抗寒性特点

1.1 越橘越冬伤害主要类型

越橘越冬伤害主要包括冻害、霜冻害和冬季生理干旱伤害。虽然经过充分低温锻炼的越橘抗寒力较强，但低温仍会造成越橘枝条和芽冻害。冻害发生及程度取决于冬季低温程度、持续时间及发生时间。霜冻主要发生在秋季后期耐寒性不高情况下，或是春天树液已开始流动，耐寒性逐渐丧失时，冷空气突然来临使树木遭受霜冻害。霜冻害比冬季最低温度造成的冻害更常见[5-6]，易导致花芽、花和幼果受害。如2009～2010年度秋末冬初低温锻炼未完成时的突然降温，导致青岛地区越橘霜冻害发生[7]。冬季生理干旱也称“冻旱”。相对于森林和苔原地带，在林线地带针叶树针叶角质层发育不充分及磨损引起的缓慢但长期水分损失，加上因寒冷或冻土引起的水分供应限制，最容易导致树木失水而枯死[8]。对亚寒带冬季除雪条件下欧洲越橘（Vaccinium myrtillus L.）越冬性研究表明，越冬期间树木未出现致命的冰冻胁迫及显著冰冻诱导脱水，却遭受严重的冬季生理干旱伤害[9]。研究表明，越冬期地上芽植物常经历冰冻和生理干旱胁迫，但在不同地理位置及树种中相互影响关系不同[10]。树木发生冬季生理干旱伤害与否主要与树种、品种、砧木遗传特性差异、树体越冬时状态，特别是一年生枝条越冬状态有关。根据对伤害的特征推断，辽南地区及山东青岛地区越橘越冬伤害主要是由冬季生理干旱引起[3,11]。而在辽宁丹东地区露地越橘越冬伤害是由枝条和花芽失水或冻害引起[12]。目前有关越橘生理干旱引起的伤害过程及其与生理代谢和环境因子关系、越橘枝条的解剖结构与发生生理干旱关系尚缺乏深入研究。

1.2 越橘抗寒性与基因型的关系

在不同类型越橘中，抗寒能力以矮丛越橘最强，半高丛越橘次之，高丛越橘最差。高丛、半高丛和矮丛越橘一般能忍耐至少-28.9℃低温，但有些品种会更弱些[13]。同一类型不同品种抗寒性不同，Lee等基于仲冬枝条半致死温度大小，确定21个高丛越橘品种抗寒性顺序如下：‘泽西’＞‘北陆’＞‘北蓝’＞‘迪西’＞‘伯克利’=‘塞拉’＞‘齐佩瓦’＞‘蓝金’＞‘伯灵顿’＞‘蓝线’＞‘斯巴坦’＞‘蓝丰’=‘北极星’＞‘日出’＞‘公爵’＞‘考林’＞‘赫伯特’＞‘夏普蓝’＞‘考林’＞‘蓝港’＞‘纳尔森’，半致死温度范围在-31.8～-41.1℃[14]。而魏鑫等研究认为几个高丛越橘枝条抗寒性由大至小顺序为‘蓝鸟’‘泽西’‘斯巴坦’‘伯克利’‘达柔’和‘凯瓦’，半致死温度范围在-18.6～-24.1℃[15]。两个研究结果存在较大差异，可能与植物生长环境条件及低温锻炼程度有关。兔眼越橘中‘梯芙蓝’抗冻性最强[13]。越橘抗寒性大小与叶片结构有关，通常栅栏组织与海绵组织厚度比值越大、叶肉组织结构疏松度值越小的品种抗寒性越强[16]。

1.3 越橘不同器官及部位抗寒性差异

在充分休眠的越橘植物中，茎干抗寒性通常略高于芽和根，如北高丛越橘‘早蓝’花芽在-29℃枯死，休眠枝在-34℃枯死。一般叶芽比花芽抗寒。在果树中开放的花朵损伤常由于晚冬或早春霜冻引起，可能导致产量显著降低。Rowland等对‘蓝丰’‘埃利奥特’‘汉娜’选择系、‘墨菲’和‘维口’等5个高丛越橘品种开放花的不同部位抗冻性进行测定，表明对冰冻温度敏感性由高到低的花部位分别为花冠、花丝、花药、花柱、子房外部、柱头、胚珠、子房内部和胎座；不同越橘基因型之间花柱、花丝、花药和子房外部抗冻性差异显著[17]。总体而言，‘蓝丰’的花对冰冻温度最敏感，而‘汉娜’选择系和‘墨菲’的花最抗冻。因此可以利用高丛越橘基因型对霜冻抗性变异，培育更多抗霜冻品种。

1.4 不同越冬阶段越橘抗寒性变化

Ehlenfeldt等对7个具有不同遗传背景的越橘低温锻炼及脱锻炼过程抗寒性变化进行评估，观察到7个基因型的最高抗寒水平和达到该水平的日期以及最大低温锻炼水平不再持续和脱锻炼开始日期存在差异。高丛越橘品种‘蓝丰’‘遗产’、兔眼品种‘梯芙兰’和两个兔眼越橘杂交种（‘US1043’和‘US1056’）在12月下旬均达到最大或接近最大抗寒性（半致死温度为-22～-27℃）。半高丛越橘‘北空’和V.constablaei Gray×V.ashei‘Little Giant’的杂交种在11月结束后获得-28℃或更低的低温锻炼温度。12月下旬达到其最大抗冻性后，‘遗产’‘梯芙兰’和‘US1043’开始持续且呈相对线性的脱锻炼；而‘US1056’‘蓝丰’‘北空’和‘小巨人’维持更长的最大抗寒时间，直到3月初‘蓝丰’和‘US1056’才开始脱锻炼，3月下旬‘小巨人’和‘北空’抗寒性低于-25℃后才开始脱锻炼[18]。不同类型越橘脱锻炼后的抗寒性不同，如带有南方兔眼或常绿越橘（V.ashei或V.darrowi）基因的南高丛越橘品种‘遗产’‘奥扎克蓝’和兔眼越橘‘梯芙蓝’为-12～-14℃，而带有较多伞房花越橘（V.corymbosum L.）和矮丛越橘（V.angustifolium Ait.）基因的北高丛越橘‘蓝丰’和‘维口’为-15℃[19]。作为越橘行业标准的‘蓝丰’在低温锻炼、脱锻炼速度和最大抗冻性方面均处于中间水平。这些研究表明越橘脱锻炼开始时期并不总是与低温锻炼能力或隆冬抗寒性相关，它们表现为不同属性，独立遗传[20]。因此在越橘品种冬季抗寒性选择和培育时，应对其分别评估。

2 越橘抗寒机制

2.1 内在冰核

在物体表面或体内结冰需要冰核的诱导和催化。现已证明，内在冰核剂在零下低温具有活性，尤其在木本植物中[21]。即使不存在外源性冰核剂，这些内在冰核剂的存在也限制植物在0℃以下深过冷却能力。耐寒木本植物组织在冰点以下温度具有不同的、可控的冻结行为，包括细胞外结冻（如树皮）、深过冷却（木质部射线薄壁组织）和外部器官结冻（如花芽和叶芽）。这几种结冻类型具有物种和组织专一性，是决定其抗寒性和冬季生存程度重要因素[22]。

控制冰核形成是耐寒植物组织为诱导细胞外结冻和/或用于在特定组织容纳冰晶避免原生质过度过冷却的重要机制。冰核活性（Ice nucleation activity，INA），指一个组织诱导异构冰核形成的能力。在抗寒性存在差异的高丛越橘品种‘维口’和兔眼越橘‘伍德’中发现极高水平的INA（-1～-4℃），比其他耐寒树种更大，沿当年生长茎均匀分布。茎INA主要定位于树皮，而木质部和髓部的INA非常低。树皮INA大多位于细胞壁部分（细胞壁和细胞间的结构成分）。胞内成分具有很少INA。不同品种INA差异与在干燥表面条件下树皮的内在冻结行为（细胞外冻结）、树皮冰柱堆积和初始冰核的形成一致。茎干INA能够忍耐各种抗菌处理。这些特性和具体定位意味着越橘茎中高INA起源于内部，作为冰点以下温度传感器有助于树皮胞外空间冻结自发开始[23]。

2.2 越橘抗寒的分子机制

近年来，越橘低温锻炼的基因组学和转录组学研究取得较快进展，鉴定一些与越橘低温锻炼有关或有助于抗寒的基因。Dhanaraj等使用来自低温锻炼和非低温锻炼的越橘花芽RNA建造cDNA文库，分析表明，在两种条件下β-淀粉酶、脱水蛋白、早期光诱导蛋白和衰老相关蛋白转录调节有显著差异[24]。Naik等使用抑制差减杂交方法鉴定高丛越橘在需冷量为400 h（低温锻炼后）和0 h（低温锻炼开始）时花芽差异表达基因，表明编码钙调蛋白、几丁质酶、推测的myb相关蛋白、推测的bZlP蛋白、锌指蛋白、AP2结构域蛋白、碱性-螺旋-环-螺旋转录因子的基因与越橘抗寒性有关[25]。Dhanaraj和Rowland等利用微阵列技术提供冷室和野外两种低温锻炼条件下越橘基因表达差异证据，鉴定两个低温锻炼体系中与拟南芥（Arabidopsis thaliana）冷响应途径相同的部分基因，比如编码肌醇半乳糖苷合成酶、β-淀粉酶、胚胎发育晚期丰富蛋白（LEAs）、脱水蛋白以及ELIPS基因，同时鉴定拟南芥中没有出现而在越橘中受低温诱导的基因，其中包括编码生长素抑制蛋白、蛋白激酶PINOID、裂解酶样蛋白和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因[26-27]。在冷室内受诱导基因的数目是野外受诱导基因的两倍，但越橘植株在野外条件下比冷室内抗冻力低3℃，这表明不是所有冷室环境诱导基因都有利于提高抗寒性。某些基因在这两种环境下诱导，尤其是与光胁迫相关基因，但在野外条件下的水平高于冷室条件。

Rowland等在微阵列研究基础上使用新一代Roche 454测序技术进行越橘低温锻炼的转录组研究[28]。鉴定以前研究中未发现的差异表达的转录本，例如编码焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶、精氨酸脱羧酶、脂氧合酶、脱落酸胁迫成熟蛋白和推定蛋白均在低温锻炼的最早阶段（0个需冷单位）水平高，随低温锻炼进行而下调，脱锻炼开始后又上调。另一方面，编码脂质转移蛋白、氨基酸选择性通道蛋白、Pointed First Leaf和高迁移率族蛋白在0个需冷单位时低水平表达，随低温锻炼进行而上调，后在脱锻炼过程中下调。Die等通过使用新一代转录组测序方法对越橘花芽两个库（0和397个需冷量单位）低温锻炼响应途径进行数据挖掘[29]。在397个需冷单位库中唯一表达的基因包括：①编码与冷信号传导有关的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酶、三磷酸肌醇基因、Ca2+介导的信号和Ca2+通道基因；②编码与甘露醇、肌醇和山梨糖醇等冷冻保护剂生物合成有关的基因；③编码转录因子bZIP、CO-like、MYB和C3H型锌指蛋白的基因。

综上研究表明，越橘低温锻炼后上调基因主要分为：①与冷信号传导有关的基因；②与冷冻保护剂生物合成有关的基因；③脱水蛋白基因；④抗冻蛋白基因；⑤与光合作用有关蛋白的基因；⑥转录因子基因。

2.2.1 冷诱导的调节基因和调节蛋白

近年来，发现部分冷诱导基因编码蛋白具有调控转录作用。这类蛋白主要为转录因子类，最典型的是CBF（CRT/DRE binding factor）、锌指蛋白和碱性亮氨酸拉链蛋白（Basic leucine zipper，bZip）家族成员等，但对其下游目标相对了解有限[30]。CBF基因在热带、亚热带植物和温带木本植物中广泛存在，具有保守结构和功能。Naik等鉴定高丛越橘花芽抗冻锻炼诱导的CBF基因，与CBF基因家族成员具有显著同源性[25]。研究表明，与南方冷敏感品种相比，抗冻性强的北高丛越橘品种中的一个BB-CBF基因在低温锻炼早期高水平表达，随后使克隆的高丛越橘CBF基因在拟南芥中超表达，导致转基因植物COR（冷调节基因）的诱导表达和抗寒性形成。表明越橘低温锻炼途径保留和利用CBF系统的功能组件[31]。此外，BB-CBF基因在非低温锻炼的冷敏感南方越橘品种花芽和叶片中过表达，提高抗寒性[32]。欧洲越橘CBF基因也与抗寒性形成有关。但笃斯越橘（Vaccinium uligiuosum L.）和红豆越橘（Vaccinium vitis-idaea L.）与北高丛越橘‘蓝丰’和欧洲越橘不同，低温诱导的CBF基因与抗寒性关系不大，原因是定位于笃斯越橘细胞核中的CBF基因不稳定，而红豆越橘中CBF基因的功能可能发生变化[33]。

2.2.2 低温诱导的功能基因及表达产物

抗冻蛋白通常含有多个亲水性冰晶结合域，具有较强的抑制冰晶重结晶活性。PR-AFPs属于抗冻蛋白，如几丁质酶。几丁质酶因具有抗菌、抗寒和抗冻等多种抗逆作用而受到广泛关注[34]。Kikuchi等在高丛越橘茎皮中发现一个27 ku储藏蛋白，从该蛋白质的cDNA推导出氨基酸序列表现出与几丁质酶显著的相似之处，在低温锻炼后一直到春季保持一定的积累水平，表明其参与冬季及春季越橘茎的低温抗性反应[35]。此外，在经过充分低温锻炼的越橘花芽中也鉴定出几丁质酶基因[25]。表明几丁质酶可能在越橘抗冻中发挥重要作用。

在低温诱导的蛋白质中，包括一些与渗透胁迫有关的蛋白，如脱水蛋白以及LEA蛋白。由于胞外冰晶存在，在胞内产生明显的渗透胁迫，所以防御冰冻胁迫也需一些类似的处理渗透胁迫的方法。越橘花芽中65、60和14 ku脱水蛋白水平在需冷量积累和低温锻炼期间增加，在脱锻炼和恢复生长过程中减少，表明脱水蛋白在越橘冬季存活机制中具有重要作用[36-37]。但这种渗透保护和抗冰冻的确切机制尚不清楚。Dhanaraj等研究抗冻品种‘蓝丰’和不抗冻品种‘杰兔’在冷胁迫环境中茎和叶中14 ku脱水蛋白基因的转录和表达水平，表明冷胁迫环境诱导14 ku脱水蛋白表达，此外还发现‘蓝丰’中寒冷诱导表达的14 ku的脱水蛋白水平比在‘杰兔’中更高[38]。

Lee等对高丛越橘‘泽西’和‘夏普蓝’枝条在低温锻炼和脱锻炼期间抗冻性、碳水化合物含量和β-淀粉酶基因表达情况进行测定，表明可溶性糖中葡萄糖、果糖和棉子糖含量与抗冻性显著相关；在低温锻炼中期淀粉含量急剧减少，与β-淀粉酶基因表达水平一致，表明淀粉转化为可溶性糖[39]。引起高丛越橘抗寒性与可溶性总糖含量差异原因，可能是由相关VcBMY基因表达驱动。

在自然环境中，影响植物越冬生存环境因子不仅是气温，光也可成为胁迫因素，光可能导致光氧化损伤[40]。ELIPS是核编码、光胁迫诱导的蛋白质，位于类囊体膜，属于叶绿素a/b结合蛋白家族，在植物中广泛分布。ELIPs作为临时色素载体发挥光保护作用[41]。在越橘花芽[24,29]和杜鹃（Rhododendron catawbiense）叶[42]中发现低温锻炼高度诱导的ELIP基因，支持ELIP在冬季合成组织中对高光胁迫适应机制发挥作用。

3 越橘抗寒性分子标记及育种

传统越橘杂交育种需要人工杂交、育苗、成熟后进行子代选择、品系繁殖检测、品种鉴定等过程，需要10年以上才能培育一个新品种。遗传标记和基因工程等现代育种技术可加快越橘育种进程。

3.1 越橘抗寒性遗传分析

大多数植物抗寒性遗传复杂。不同植物遗传方式不同，甚至同一植物研究结果也不同。如苹果（Malus domestica）对寒害的敏感性，属于微效多基因控制数量性状；梨（Pyurs spp.）抗寒性是多基因控制的数量性状，杂种后代趋中变异，平均抗寒水平介于双亲之间，但有超亲植株出现[43]。Arora等利用二倍体越橘Vaccinium darrowi和Vaccinium caesariense作为亲本进行杂交，分析F1及F1与双亲回交获得的两个F2回交群体中抗寒相关基因的遗传和分离，其抗寒性评估结果表明，两个亲本抗寒基因是纯合的；亲本和F1抗寒能力的评价表明抗寒性是不完全显性性状；F2群体测试结果表明不同个体间抗寒能力无显著差异，主要由基因加性效应控制[44]。

3.2 越橘抗冻性分子标记及辅助育种

将气候适应性及其他重要特征（如果实营养品质相结合）的分子标记有效利用对于遗传改良非常有利。越橘等木本植物具有世代周期长、杂合度高、自交不育、近交衰退以及商业类型的多倍性等特点，尤其适合于分子标记辅助育种进行遗传改良。在越橘中已构建二倍体与四倍体的RAPD标记的遗传连锁图谱，鉴定出能够区分20%基因型差异的抗寒性数量性状位点（QTL）。Qu等利用RAPD技术建立基于四倍体越橘的遗传连锁图谱，定位果实品质、耐热性和耐寒性的连锁基因。作图群体由‘US 75’[四倍体杂种由二倍体‘Fla 4B’（Vaccinium darrowi）选择系和四倍体‘蓝丰’杂交的后代]和高丛越橘‘蓝塔’杂交得到，获得140个RAPD标记，覆盖29个连锁群。由于‘US 75’通过四分体模式遗传，可能使用标记辅助选择鉴定有足够抗寒力和需冷量的越橘分离子代[45]。Rowland等利用花芽发育、低温锻炼、需冷量积累和果实发育过程转录组测序获得EST开发SSR标记，对四倍体作图群体和二倍体作图群体多态性测定，结果表明SSR引物整体放大率达68%，而多态率达43%[28]。Panta等报道脱水蛋白基因与已有越橘遗传连锁图谱中的连锁群12有关[46]。刘肖选取‘蓝丰’‘粉蓝’‘夏普蓝’‘美登’及两个我国特有野生越橘资源进行SNP标记开发，确定与抗寒性性状相关的SNP标记SL8088，同时利用与抗冻性性状相关的SNP标记对29份杂交F1代实生苗DNA进行早期鉴定，筛选出2个抗寒性突出的杂交优株[47]。Rowland等建立种间杂交二倍体越橘[（Vaccinium darrowii‘Fla 4B’×Vaccinium corymbosum‘W85-20’）F1‘#10’×V.corymbosum‘W85-23’]遗传图谱，包括12个连锁群，总长1740 cM[48]。图谱包含基于简单重复序列、表达序列标签聚合酶链式反应、单核苷酸多态性以及随机扩增多态性DNA的265个标记。使用图谱群体评估控制条件下2个周期的冬芽抗寒性，其广义遗传力为0.88；鉴定抗寒性数量性状位点至少在2年内一致。

综上所述，虽然国内外越橘抗寒性分子标记辅助育种研究取得一定进展，但与生产需要还有很大距离，需要开展进一步研究，发现更多与抗寒性连锁的基因位点，筛选和培育抗寒品种。

3.3 越橘抗寒基因工程育种

随着对抗寒分子机理认识不断深入，基因工程手段培育抗寒新品种方法以周期短、见效快的优点逐渐在植物遗传育种中占有重要地位。分离于北高丛越橘品种‘蓝丰’的CBF基因，通过使用CaMV 35S启动子控制其在南高丛越橘品种‘遗产’植株中过表达，结果显示，后者抗寒性增强，表明操纵CBF系统可能有益于改善木本果树抗寒性[32]。Zhao等将来自柽柳（Tamarix androssowii）的LEA基因转入半高丛越橘‘北陆’中，对其抗寒性进行研究[49]，发现转入的LEA基因大部分均能正常表达，提高越橘抗寒性。尽管在越橘中已鉴定出许多与抗寒性有关的基因，但真正用于转基因育种的很少。

4 存在的问题及展望

近年来，越橘作为经济价值较高的温带经济树种受到重视。其抗寒性基因组和功能基因组研究取得较快进展，鉴定一些参与抗寒锻炼基因，如CBF/DRE基因、抗冻蛋白基因以及脱水蛋白基因。但越橘抗寒分子机制研究相对薄弱，今后应从以下方面开展研究：

①越橘感受和转导信号机制；②通过低温胁迫蛋白质组学和代谢组学解释越橘抗寒分子机制；③研究除CBF转录因子外其他转录因子调控抗寒基因表达机制及其在越橘转基因抗寒育种中的应用；④越橘属植物资源丰富，如我国北方地区的红豆越橘、笃斯越橘、朝鲜越橘（V.koreanum）等，但对抗寒性研究较少，应对引进的国外优良品种和我国野生种质资源抗寒性进行深入研究，开发抗寒性强、适应我国寒冷地区栽植的越橘品种资源及基因资源；将分子标记辅助育种和转基因技术与常规育种技术结合，加速越橘抗寒育种进程。

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Research advance of blueberry cold hardiness

/
WU Fengzhang
(Modern Agriculture ResearchAcademy of Dalian University,Dalian Liaoning 116622,China)

Low temperature is an important environmental stress factor limited blueberry cultivation region and affected fruit yield.In recent years,using genomics and transcriptomics approach identified many genes or proteins related to blueberry cold hardiness,provided the basis for developing new blueberry cold hardiness cultivars.The characteristics of blueberry cold hardiness,internal ice nucleation distribution, molecular mechanisms of cold hardiness and molecular marker assisted breeding were summarized in the paper,and prospecting the research direction of blueberry cold hardiness.

blueberry;cold hardiness;low-temperature acclimation;research progress

S727.3

A

1005-9369（2015）09-0102-07

时间2015-9-23 9：38：09[URL]http：//www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150923.0938.008.html

乌凤章.越橘抗寒性研究进展[J].东北农业大学学报,2015,46(9):102-108.

Wu Fengzhang.Research advance of blueberry cold hardiness[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(9): 102-108.(in Chinese with English abstract)

2015-05-06

辽宁省科技攻关及成果产业化项目（2013204001）；辽宁省教育厅科学技术研究项目（L2014497）

乌凤章（1965-），男，副教授，博士，研究方向为果树学。E-mail：wfz1965@126.com