大鼠不同部位脂肪形态及功能的差异

王晨，刘娟，孙坤，俞静，丁国宪

(南京医科大学第一附属医院 老年医学科，江苏 南京 210029)

·论 著·

大鼠不同部位脂肪形态及功能的差异

王晨，刘娟，孙坤，俞静，丁国宪

(南京医科大学第一附属医院 老年医学科，江苏 南京 210029)

目的:探讨大鼠不同部位脂肪组织形态和功能差异，为更好地解释代谢综合征的发病机制提供依据。方法:收集SD大鼠各部位脂肪组织样本，采用HE染色方法观察脂肪细胞大小和形态，行细胞RNA抽提及cDNA转录，应用实时定量PCR检测脂肪相关基因表达，抽提总蛋白并应用Western blot方法检测脂肪特异性功能蛋白表达。结果：附睾旁、肾周、肠系膜周围等内脏脂肪细胞较皮下脂肪细胞体积大，肩胛间、肩胛下、脊柱旁等棕色脂肪细胞最小。棕色脂肪功能基因(UCP-1、Cidea、PGC-1α)在大鼠的肩胛下、肩胛间、甲状腺下、脊柱旁脂肪组织高度表达，与经典白色脂肪(附睾旁脂肪)相比，差异有统计学意义(P<0.05)，而皮下白色脂肪组织(white adipose tissue， WAT)(如腹股沟、腋下、甲状腺旁)及内脏WAT(如附睾旁、肾周、肠系膜周围)则以白色脂肪功能基因(AP2、HOXC9、Leptin)表达为主，与经典棕色脂肪(肩胛下脂肪)比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且经典皮下WAT(腹股沟皮下)和经典内脏WAT(附睾旁)的棕色、白色脂肪功能基因表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。附睾旁、肾周、肠系膜周围等内脏脂肪组织炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1表达水平较高，与经典棕色脂肪(肩胛下脂肪)相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论：不同部位脂肪组织细胞大小以及炎症状态的差异，可能与代谢综合征的发病机制密切相关，而脂肪的棕色功能差异可能与代谢紊乱疾病的发生无明显相关性。

棕色脂肪；功能；炎症；代谢综合征

近来研究显示，脂肪组织不仅是储能的重要组织，也是人体最大的内分泌器官，可通过其分泌因子如脂肪因子、炎症因子、棕色化因子等调控周围器官的功能[1-2]。已知腹型肥胖与代谢综合征的关系较单纯性肥胖更为密切[3]，提示不同部的位脂肪其功能亦有所差别。目前尚未有关于动物或人体不同部位脂肪功能的探讨。本研究以大鼠为实验对象，探讨不同部位脂肪组织形态、功能基因及蛋白表达差异，为更好地解释代谢综合征的发病机制提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1动物 健康雄性SD大鼠10只，非特定病原体(SPF)级，体重(220±10) g，由南京医科大学实验动物中心提供。

1.1.2试剂 RNA提取液Trizol(Invitrogen公司，美国)，鼠白血病病毒反转录酶、三磷酸脱氧核酸核苷、RNA水解酶抑制剂等逆转录所用试剂(Promega公司，美国)，荧光定量PCR 试剂Quanti Tect SYBR Green PCR Master Mix(Toyobo公司，日本)。UCP-1蛋白一抗(Abcam公司，美国)，Tublin蛋白一抗(Sigma公司，美国)，UCP-1、Tublin蛋白二抗(Vector公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1脂肪样本收集 采用脊柱脱臼法处死所有大鼠，解剖暴露脂肪组织，拍摄大体标本照片，将腹股沟、附睾旁、肠系膜周围、肾周、腋下、肩胛间、肩胛下、脊柱旁、甲状腺旁、甲状腺下脂肪组织取出，于-70 ℃冻存以备后续实验。

1.2.2脂肪组织HE染色 取大鼠各部位脂肪，大小约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，浸泡于10%甲醛中固定，送病理实验室行石蜡包埋、切片、水化、漂洗、封闭、HE染色，光镜观察。

1.2.3细胞RNA抽提及cDNA转录 取冻存的大鼠不同部位脂肪组织各100 mg，融化后分别加入Trizol 1 ml，匀浆机破碎组织，按RNA提取试剂盒的说明进行细胞总RNA抽提及cDNA逆转录。

1.2.4相关基因的检测 以cDNA为模板，用相关引物进行实时荧光定量PCR扩增，引物设计见表1。总反应体系为20 μl，反应条件:95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s；40个循环，绘制熔解曲线。读取Ct值，以β-actin基因作为内参照计算样品目的基因与内参照之间的拷贝数之比，并进行统计分析。

1.2.5组织总蛋白抽提及Western blot检测 取冻存的相关组织融化后匀浆，按照试剂盒说明书提取组织蛋白并测其浓度，加入loading buffer，煮沸5 min使蛋白变性；行聚丙烯酰胺凝胶电泳(12%分离胶和5%浓缩胶)；转膜，用5%TBST配制的牛奶封闭1 h；分别加入UCP-1一抗(1∶3 000)、Tublin一抗(1∶2 500)，UCP-1二抗(1∶30 000)、Tublin二抗(1∶20 000)孵育。按发光液试剂盒(美国Pierce公司)说明进行发光。

1.3 统计学处理

数据用SPSS 11.0统计软件进行分析，结果采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脂肪部位及形态

肠系膜、附睾、肾脏等内脏周围脂肪细胞较甲状腺旁、腋下、腹股沟等皮下脂肪细胞体积大；肩胛间、脊柱旁、肩胛下等棕色脂肪细胞与内脏、皮下白色脂肪细胞相比，棕色脂肪细胞体积及脂滴空泡明显小(图1)。

表1 实时定量PCR引物序列

A.甲状腺旁脂肪；b.腹股沟皮下脂肪；c.腋下脂肪；d.肩胛间棕色脂肪；e.脊柱旁脂肪；f.肩胛下脂肪；g.肠系膜周围脂肪；h.附睾旁脂肪；i.肾周脂肪 HE ×10

图1 SD大鼠各部位脂肪组织HE染色

2.2 相关脂肪基因表达

棕色脂肪功能基因(UCP-1、Cidea、PGC-1α)在大鼠的肩胛下、肩胛间、甲状腺下、脊柱旁脂肪组织中高度表达，与经典白色脂肪(附睾旁脂肪)相比，差异有统计学意义(P<0.05)；而皮下白色脂肪组织(white adipose tissue， WAT)(如腹股沟皮下、腋下、甲状腺旁)及内脏WAT(如附睾旁、肾周、肠系膜周围)则以白色脂肪功能基因(AP2、HOXC9、Leptin)表达较高，与经典棕色脂肪(肩胛下脂肪)相比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且经典皮下WAT(腹股沟皮下)和经典内脏WAT(附睾旁)的棕色、白色脂肪功能基因表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。附睾旁、肾周、肠系膜周围等内脏脂肪组织炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1表达水平较高，与经典棕色脂肪(肩胛下脂肪)相比差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

A

B

C

A.大鼠附睾旁、腋下、肾周、肠系膜、甲状腺旁、腹股沟皮下、肩胛间、肩胛下、甲状腺下、脊柱旁脂肪组织棕色脂肪功能基因(UCP-1、Cidea、PGC-1α)mRNA的表达量，与经典白色脂肪(附睾旁脂肪)相比差异有统计学意义(aP<0.05)；B.大鼠附睾旁、腋下、肾周、肠系膜、甲状腺旁、腹股沟皮下、肩胛间、肩胛下、甲状腺下、脊柱旁脂肪组织白色脂肪功能基因(AP2、Leptin、HOXC9)mRNA的表达量，与经典棕色脂肪(肩胛下脂肪)相比差异有统计学意义(aP<0.05)；C.大鼠附睾旁、腋下、肾周、肠系膜、甲状腺旁、腹股沟皮下、肩胛间、肩胛下、甲状腺下、脊柱旁脂肪组织炎症因子(TNF-α、IL-6、MCP-1) mRNA的表达量，与经典棕色脂肪(肩胛下脂肪)相比差异有统计学意义(aP<0.05)

图2 SD大鼠各部位脂肪基因表达

2.3 脂肪特异性功能蛋白表达

脂肪棕色功能标志UCP-1蛋白在大鼠的脊柱旁、肩胛间、心周脂肪组织表达量高于其他部位，皮下WAT和内脏WAT(除心周脂肪)的UCP-1蛋白表达量无明显差异(图3)。

图3 SD大鼠各部位脂肪UCP1蛋白表达

3 讨 论

随着社会经济的发展，代谢综合征的发病率逐年升高，已严重威胁人类健康，脂肪组织与其发病机制密切相关。研究发现，皮下、内脏周围等不同部位脂肪组织功能的差异并非周围环境所致，而是因其内在的根本性差异。哺乳动物主要含有WAT和棕色脂肪组织(brown adipose tissue，BAT)两种。目前认为，皮下WAT和BAT参与维持机体能量的稳态和代谢的平衡，而内脏WAT则参与代谢性疾病的发生。WAT主要通过分泌多种脂肪因子、炎症因子等影响机体代谢[4]。BAT主要是通过线粒体解耦联蛋白-1(uncoupling protein 1，UCP-1)来发挥产热和消耗能量的作用。人体的相关研究发现，大网膜、肾周、附睾旁等部位的内脏WAT与胰岛素抵抗、糖尿病等心血管疾病危险因素的相关性比大腿、臀部处的皮下WAT更高[4-6]。本研究发现，棕色脂肪功能基因(UCP-1、Cidea、PGC-1α)在大鼠的肩胛下、脊柱旁、甲状腺下脂肪组织高度表达，而皮下WAT(如腹股沟、腋下、甲状腺旁)及内脏WAT(如附睾旁、肠系膜周围、肾周)则以白色脂肪功能基因(HOXC8、HOXC9、Leptin)表达为主，且经典皮下(腹股沟皮下)WAT和经典内脏(附睾旁)WAT的棕色、白色脂肪功能基因表达无显著性差异。这些结果提示不同部位棕色脂肪功能的显著差异可能并不是腹型肥胖患者更易出现代谢紊乱及心血管并发症的重要原因。

近来研究发现，脂肪细胞的大小及功能与脂肪组织的分布密切相关，脏器周围脂肪组织细胞体积明显较皮下脂肪细胞大[4-6]。扩张的脂肪组织，因血液供应减少，引起脂肪细胞中细胞器如内质网、线粒体的氧化应激功能障碍，最终导致各种脂肪细胞因子分泌失常[8-9]。肥大的脂肪细胞将产生大量的促炎细胞因子，例如TNF-α、IL-6、MCP-1等。本研究在大鼠模型中亦发现附睾旁、肾周、肠系膜周围等内脏脂肪组织上述炎症因子的表达水平较高。这些因子将激活巨噬细胞，继而向脂肪组织大量浸润，导致机体处于一种慢性炎症状态，最终导致代谢相关性疾病的产生以及周围脏器的功能障碍[10]。

综上所述，不同部位的脂肪组织在代谢及内分泌功能方面存在明显差异。内脏脂肪组织的堆积易导致胰岛素抵抗、糖利用障碍及脂肪分解增加，是代谢综合征发生的关键因素。本研究发现，不同部位脂肪组织细胞大小以及炎症状态的差异，可能与代谢综合征的发病机制密切相关，而棕色脂肪功能差异可能与代谢紊乱疾病的发生无明显相关性。脂肪组织的形态和部位多样性使肥胖的治疗变得更加复杂及重要，具体而有效的防治措施还有待进一步研究发现。

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Difference of the adipose forms and functions in rat′s different parts

WANG Chen，LIU Juan，SUN Kun，YU Jing，DING Guo-xian

(DepartmentofGeriatrics，theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China)

Objective: To explore the difference of adipose forms and functions in rat′s different parts in order to provide evidence for better explanation of the pathogenesis of metabolic syndrome. Methods: The adipose tissue samples of rat′s different parts were collected. HE staining was adopted to observe the sizes and forms of adipose cells. Cell RNA extraction and cDNA transcription were carried out to accept the inspection with real-time quantified PCR in respect of the expression of related genes. Total protein was extracted and applied with Western blot to inspect the expression of the specific functional protein of fat. Results: The visceral adipose cells around epididymis， kidney， and mesentery were relatively large in size than the subcutaneous adipose cells while the brown adipose cells between scapulars， below scapulars and beside spine were the smallest. The brown adipose functional genes (UCP-1， Cidea， and PGC-1α) were highly expressed in the adipose tissues below scapulars and thyroid as well as beside the spine of rats than the classic white adipose(around epididymis adipose)(P<0.05). The subcutaneous WAT (such as around groin， armpit and thyroid) as well as the visceral WAT (around epididymis， kidney and mesentery) were mainly expressed as white adipose functional genes (AP2， HOXC9 and Leptin) than the classic brown adipose(below scapulars adipose)(P<0.05)， and there was no significant difference (P>0.05) in the brown and white adipose functional gene expression of classic subcutaneous(around groin) and visceral(around epididymis) WAT. The inflammatory factors(TNF-α， IL-6 and MCP-1) had high expression level in the visceral adipose tissues around the epididymis， kidney and mesentery than the classic brown adipose(below scapulars adipose)(P<0.05). Conclusion: The difference of the adipose tissue cell size and inflammatory state in different parts of rats may be closely related to the pathogenesis of metabolic syndrome， and the difference in the brown functions of fats may has no significant correlation with the occurrence of metabolic disorders.

brown adipose tissue; function; inflammation; metabolic syndrome

2014-11-07

2015-01-22

王晨(1989-)，女，江苏南京人，在读硕士研究生。E-mail:343959616@qq.com

丁国宪 E-mail:dinggx_jsph@163.com

王晨，刘娟，孙坤，等.大鼠不同部位脂肪形态及功能的差异[J].东南大学学报:医学版，2015,34(3)：399-404.

R-332

A

1671-6264(2015)03-0399-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.017