蚓激酶的抗菌作用研究

李秦晋，符文卉，魏宝阳，王 智

（1. 湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2. 湖南体育职业学院，湖南 长沙 410019）

蚓激酶的抗菌作用研究

李秦晋1,2，符文卉1，魏宝阳1，王 智1

（1. 湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2. 湖南体育职业学院，湖南 长沙 410019）

利用杯碟法探讨了蚓激酶对细菌、真菌等的抗菌效果。从蚯蚓中提取蚓激酶经过分离纯化后采用杯碟法对大肠杆菌、K酵母、康氏木霉、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌进行抗菌作用研究，通过量效、时效检测得出蚓激酶均对上述5种微生物产生了不同程度的效果，以大肠杆菌和K酵母作用尤为显著。

蚓激酶；抗菌；杯碟法；蚯蚓

蚓激酶是从露天红赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）中提取的一种具有纤维蛋白溶解活力的丝氨酸蛋白酶[1-5]。它可直接溶解纤维蛋白，并具有纤溶酶原激活剂的作用，病人应用后可促进纤维蛋白的溶解，改善凝血及血液流变学指标[2,6-9]。蚓激酶含有的纤溶酶原激活剂成分可以促使纤溶酶原转化为纤溶酶降解纤维蛋白，使早期脑梗死的血栓溶解；含有的纤维蛋白溶酶可直接水解纤维蛋白原从而预防血栓形成[10-14]。此外蚓激酶还可降解凝血酶原、凝血因子V和凝血因子Ⅷ抗血小板聚集针对缺血性卒中患者的高黏、高凝、低纤溶状态展示出更广泛的治疗作用[15-16]。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验材料 湖南常见红蚯蚓，即赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）采自湖南农业大学校园。

1.1.2 供试菌株 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、康氏木霉（Trichoderma koningii）、枯草芽孢杆菌（Bacillus sabtilis）、K酵母（Saccha-romyces cerevisiae K）和大肠杆菌（Escherichia coli）均由湖南农业大学生物科学技术学院微生物研究室提供。

1.1.3 培养基配方 细菌培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，NaC1 0.5%，琼脂1.5%，蒸馏水1 000 mL，121℃灭菌25 min。

霉菌培养基：PDA培养基，琼脂1.5%，蒸馏水1 000 mL，121℃灭菌25 min。

1.2 方 法

1.2.1 蚓激酶的分离纯化 取10条活的赤子爱胜蚓，多次水洗，待内脏中的污物排出后，用滤纸吸除水分，然后称重；再加2倍体积的缓冲液于匀浆器中匀浆5 min，在4℃冰箱中静置4 h后以4 000 r/min离心10 min，将沉淀弃去；在上清液中加固体硫酸铵达一定饱和度，以同样的方式再次离心10 min；收集上清液再加入固体硫酸铵达较高的饱和度，通过12 h静置后再高速离心，将收集的沉淀物用缓冲液溶解，用超滤方法浓缩或透析袋透析去盐后，用冷冻干燥机冻干得到淡棕色粉末状的蚓激酶粗制品。

1.2.2 抗菌活性的检测 在试验前，先用无菌蒸馏水将蚓激酶分别配成每1mL中含10 000、8 000、6 000、4 000蚓激酶单位的粗酶液和不加酶液空白对照。采用杯碟法，选择在直径为9 cm无菌培养皿中注入10 mL融化的无菌培养基作为底层。等到培养基冷却凝固且扩展均匀后，再取适量无菌培养基加热至50～55℃，然后不断摇匀加入适量供试菌悬液，迅速倒入已注入10 mL融化的无菌培养基作为底层的培养皿中作为菌层，在菌层还未凝固前，快速安放4个无菌牛津杯，等到凝固后，在牛津杯中加入10 000、8 000、6 000、4 000酶单位的粗酶液和空白对照浓度，细菌于32℃培养36 h，霉菌于30℃培养60 h，定时观察抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 蚓激酶不同剂量抗菌效果检测

以每1 mL中含10 000、8 000、6 000、4 000蚓激酶单位的粗酶液和不加酶液的空白对照，以大肠杆菌、K酵母、枯草芽孢杆菌、康氏木霉和金黄色葡萄球菌为供试菌种，作抗菌活性检测，结果发现以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、K酵母、康氏木霉、枯草芽孢杆菌为试验菌均出现明显的抑菌圈。并且还发现，10 000酶单位/mL的蚓激酶对大肠杆菌（抑菌圈11.6 mm），K酵母（抑菌圈11.6 mm）的抑菌活性最强，金黄色葡萄球菌（抑菌圈11.3 mm）和枯草芽孢杆菌（抑菌圈11.0 mm）次之，对康氏木霉（抑菌圈10.0 mm）抑菌活性最弱 （表1～表5）。

2.2 蚓激酶抗菌时效检测

从表1～表5可知，蚓激酶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、K酵母、康氏木霉和枯草芽孢杆菌的抗菌效果在指定时间内基本达到较佳的效果，再随时间的延长其抑菌能力虽略有增加，但均不显著。

3 讨 论

试验结果表明，蚓激酶对革兰氏阴性菌，如大肠杆菌等的抗菌活性较对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等阳性菌强。蚓激酶对K酵母也具有较强抑菌活性。同时也发现蚓激酶对康氏木酶等霉菌抗菌效果不是很明显。总的来说，蚓激酶中的抗菌肽对细菌有强烈抑制的作用，但是具有一定的选择性，对大肠杆菌等革兰氏阴性菌抗菌效果比阳性菌强；蚓激酶对K酵母同样作用效果理想，但对康氏木酶等霉菌作用效果相对较差，这对于进一步研究蚓激酶中抗菌肽的作用提供了参考。对蚓激酶各组分的作用和相互作用的研究以及分离纯化的工艺等有待深化，对其作为酶类药物的有效机理还要进一步研究。

传统的抗生素在使用过程中产生了诸多的新问题，如不断出现的各种耐药菌株以及变异菌株等，这就使得抗生素必须不断更新换代。因此，寻找新一代抗菌剂就变得越来越重要。虽然人们早就发现生物体内具有高效的免疫系统，也有不少有关生物血淋巴中抗菌肽的研究报道[16-17]，但它们的产生大多是由于生物体受到损害或相关理化因素作用后在体内诱导的。试验中蚓激酶有较强的抗菌作用，说明蚯蚓体内均含有抗菌肽。目前，有关蚓激酶的抗菌研究报道甚少，此项研究为以后的相关研究提供了参考。

文中对蚓激酶在抗菌作用方面只是做初步的探讨和检测，但是效果较理想，证明蚓激酶确实对细菌、霉菌均具有一定的抑制作用。蚓激酶是1992年在我国投入临床应用的，在用于防治心脑血管疾病上积累了丰富的研究资料[18-20]，本文提出的蚓激酶抗菌作用为新抗生素提供了新的思路和方法，相信在不久的将来蚓激酶会越来越受到人类的关注，在稳定性好、纤溶活性强、药理作用广泛、口服有效、副作用小的基础上开发出更多利于人类的药物。

[1] 姜东胜，张国桢，王宝珍，等. 赤子爱胜蚓纤溶酶的药理性质探讨[J].上海医科大学学报，1993，20（1）：16-20.

[2] Augmentin. 在感染性疾病现代疗法中的重要地位[J]. 国外医药抗生素分册，1998，19（6）：433.

[3] Kobayashi H. Bioflm diseases: its clinical manifestation and therapeutic possibilities of macrolide[J]. Am J Med, 1995, 99(Suppl6A): 26.

[4] Chen Q, Wang R, Fang X Q, et al. Effects of feroxacin hydrochloride on bacterialbioflm induced by Pseudomonas aeruginosa[J]. Chin J Antibiot, 1997, 22: 435.

[5] Selan L, Berlutti F, Pasariello C, et al. Proteolyticenzymes: a new treatment strategy for prostheticinfections[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1993, 37: 2618.

[6] 杨 斌，操二虎，邓子新. 提高棒状链霉菌中克拉维酸产量的可能途径[J]. 国外医药（抗生素分册），1998，19（6）：419-422，425.

[7] Woods G L, Washington J A. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods[M]. Washington DC: ASM Press, 1995. 1327. [8] Passariello C, Berlutti F, Selan L, et al. A rapid staining procesure to demonstrate glycocalyx production and bacterial biofilms[J]. Microbiologica, 1994, 17: 225.

[9] Marrie T J and Costerton J W. Scanning and trasmission electron microscopy of in situ bacterial colonization of intravenous and intraarterial catheter[J]. J Clin Microbiol, 1984, 19: 687.

[10] 朱力山，丁进芳，边 军，等. 不同药物剂量对脑梗死康复期病人缺血性卒中再发对比分析的预防[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2001，5（1）：55-56.

[11] Costeroton J W, Leandowski Z, Caldwell D E, et al. Microbial bioflm[J]. Annu Rev Microbiol, 1995, 49: 711.

[12] Wang R and Fang X Q. The characteristics and treatment of bacterial bioflm-associated infections[J]. World Notes on Antibiotics, 1998, 19: 50.

[13] Wang Q, Wei H R. Effects of urokinase in cultured human trabecular meshwork cellsin vitro[J]. JInj Occup Dis Eye Ophthal Surg, 1997, 19: 192.

[14] Zhao H F, Geng R H. Effects ofurokinase and earthworm kinase on fbrinogenolysis biosystem in patients with coronary heart disease[J]. Clin Pharm, 1997, 17: 7.

[15] 杨 明，董桂华，张风琴，等. 赤爱胜蚯蚓纤溶酶的研究：Ⅳ.蚯蚓溶栓酶对家兔血栓溶解及大鼠实验性脑缺血的保护作用研究[J].生物技术，1995，5（3）：9-11.

[16] 王彦生，富成志. 双胸蚯蚓溶栓酶对沙土鼠脑缺血再灌注脑匀浆中ET，TXB2和6-keto-PGF1α的影响[J]. 沈阳医学院学报，1997，11（1）：5-7.

[17] 吴甜甜，杨 洁. 天然抗菌肽的研究进展及应用前景[J]. 生物技术通报，2009，（1）：27-31.

[18] 章洪斌，弓 弦，程 武，等. 蚓激酶肠溶胶囊预防脑梗死复发58例[J]. 江西中医药，2007，38（10）：25-25．

[19] 董 强，乔 健，史郎峰，等. 蚓激酶胶囊治疗脑梗死患者的疗效和安全性[J]. 中国新药杂志，2004，13（3）：257-260.

[20] 周永炜，王文安，浦 政，等. 蚓激酶胶囊联合阿司匹林治疗急性期脑梗死患者的疗效和安全性观察[J]. 临床内科杂志，2006，23（6）：413-414.

（责任编辑：高国赋）

Anti-Microbial Effects of Lumbrokinase

LI Qin-jin1,2，FU Wen-hui1，WEI Bao-yang1，WANG Zhi1

（1. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. Hunan Sports Vocational College, Changsha 410019, PRC）

This study was conducted to investigate anti-microbial effect of lumbrokinase on bacteria and fungi with cylinder plate method. The lumbrokinase extracted from the earthworm was separated, purifed and then used with the cylinder plate method to test its antimicrobial effect on Escherichia coli, Saccha-romyces cerevisiae k, Trichoderma koningii, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. Through the dose-effect and aging-effect test, the lumbrokinase was found to produce the various-degree effects on the above-mentioned fve kinds of micro-organisms, particularly signifcant on E. coli and Saccha-romyces cerevisiae k.

lumbrokinase; anti-microbial; cylinder plate method; earthworm

R285

A

1006-060X（2015）08-0008-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.08.003

2015-05-25

湖南省科技厅重点项目（2014FJ2003）

李秦晋（1975-），男，湖南益阳市人，讲师，主要从事农业生态学研究。

王 智