细菌菌落计数培养基TTC浓度的筛选研究

刘晓颖，冯二凯，吴洪超，冯卓，李光玉

(中国农业科学院特产研究所，长春 130112)

细菌菌落计数是判别食品(或饲料)污染程度的指标，观察细菌在食品(或饲料)中的繁殖动态，以便对被检测样品进行卫生学评价[1，2]。在测定食品(或饲料)菌落总数实际工作中，常因检测样品中含有的微小颗粒沉渣与生长于琼脂内部的菌落难以区分、部分菌落细小或菌落颜色与琼脂较相近，给菌落计数带来一定的困难，进而造成实验误差。

2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)能够被细菌还原成红色物质[3]，添加到培养基中可使菌落呈红色，观测和计数时可使菌落与样品细小颗粒区分开，提高了检测效率和准确度。但过量的TTC也会抑制细菌的生长，为此，培养基中适宜的TTC浓度是准确检测细菌菌落数的重要前提。本试验探讨培养基中不同TTC浓度与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌生长数量的关系，研究TTC的安全用量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌(中国药品生物制品中心)。

1.1.2试剂蛋白胨、牛肉膏(美国BD公司)；酵母浸出粉(英国OXOID公司)；氯化钠、葡萄糖(分析纯，北京化工厂)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(分析纯，Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.11%TTC的配制称取1g TTC，加入100mL蒸馏水，完全溶解后，用0.22μm滤膜除菌，于4℃冰箱中避光保存。

1.2.2菌液制备将-20℃保存的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌的液体培养物分别接种于营养琼脂培养基上，置36±1℃培养24h，挑取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌典型菌落接种于营养肉汤中，36±1℃培养24h。比浊法确定细菌浓度约为n×108CFU/mL，以上菌液依次作10倍稀释，制备成浓度约为n×101CFU/mL的菌液。

1.2.3不同TTC浓度计数琼脂的配制计数琼脂按培养基配方称取后，调pH，分装后灭菌，待冷至56℃，分别加入无菌1% TTC溶液，使终浓度分别为0.0002%、0.0004%、0.0006%、0.0008%、0.001%、0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%，摇匀混匀，置于46℃水浴锅中备用。

1.2.4细菌的倒入参照国家标准GB4789.2-2010操作，用1mL灭菌吸管分别取上述细菌稀释液于2组灭菌平板内各1mL，将46℃水浴中含不同浓度TTC的计数琼脂(包括不含TTC)注入平板内约25mL，并转动平板使混合均匀，同时分别将平板计数琼脂25mL注入灭菌平板及加有1mL灭菌生理盐水平板内作空白和试剂对照，待琼脂凝固后翻转平板，置36±1℃温箱内培养48h，观察结果。

2 结果

2.1 大肠埃希菌在不同TTC浓度的计数琼脂培养基中的生长情况

大肠埃希菌在不同TTC浓度试验组中，TTC终浓度为0.002%时，菌落呈红色，菌落大小与对照组相当；TTC终浓度≤0.01%时，菌落数量和对照组基本相当；TTC终浓度≥0.02%时，菌落呈黑色、点状，菌落数量也明显减少(表1)。

表1不同TTC浓度计数琼脂培养基中大肠埃希菌生长检测结果

Table1BacterialcolonymorphologyandnumberofEscherichiacoliindifferentconcentrationsofTTCagarplate

TTC浓度(%)TTCconcentration菌落颜色Thecolorofthecolony菌落数Colonycount0乳 白Milkywhite45460.0002乳 白Milkywhite54430.0004肉 色Incarnadine44470.0006肉 色Incarnadine35450.0008粉 红Pink50430.001粉 红Pink36460.002红 色Red45420.004红 色Red39380.006红 色Red37420.008深红色Oxbloodred4538

续表1

TTC浓度(%)TTCconcentration菌落颜色Thecolorofthecolony菌落数Colonycount0.01紫 黑Purpleblack41470.02黑 色Black21360.03黑 色Black100.04黑 色Black010.05/000.06/00

2.2 金黄色葡萄球菌在不同TTC浓度计数琼脂培养基中的生长情况

金黄色葡萄球菌在不同TTC浓度试验组中，菌落颜色变化和大肠埃希菌组相同，只是在TTC终浓度≤0.004%时，菌落数量和对照组基本相当；TTC终浓度≥0.006%时，菌落数量明显减少；TTC终浓度≥0.02%时，几乎无菌落出现(表2)。

表2不同TTC浓度计数琼脂培养基中金黄色葡萄球菌生长检测结果

Table2BacterialcolonymorphologyandnumberofStaphylococcusaureusindifferentconcentrationsofTTCagarplate

TTC浓度(%)TTCconcentration菌落颜色Thecolorofthecolony菌落数Colonycount0乳 白Milkywhite47630.0002米 黄Riceyellow49380.0004肉 色Incarnadine50440.0006肉 色Incarnadine43390.0008粉 红Pink35600.001粉 红Pink44460.002红 色Red4554

续表2

TTC浓度(%)TTCconcentration菌落颜色Thecolorofthecolony菌落数Colonycount0.004红 色Red47460.006红 色Red31280.008深 红Oxbloodred19220.01紫 黑Purpleblack20180.02黑 色Black120.03黑 色Black120.04/000.05/000.06/00

2.3 鼠伤寒沙门氏菌在不同TTC浓度计数琼脂培养基中的生长情况

鼠伤寒沙门氏菌在不同TTC浓度试验组中，菌落颜色变化和大肠埃希菌组、金黄色葡萄球菌组变化基本相同。菌落数量在TTC终浓度≤0.01%时，和对照组基本相当；TTC终浓度≥0.02%时，菌落数量和对照组相比逐渐减少(表3)。

表3不同TTC浓度计数琼脂培养基中鼠伤寒沙门氏菌生长检测结果

Table3BacterialcolonymorphologyandnumberofSalmonellatyphimuriumindifferentconcentrationsofTTCagarplate

TTC浓度(%)TTCconcentration菌落颜色Thecolorofthecolony菌落数Colonycount0乳 白Milkywhite81850.0002乳 白Milkywhite77740.0004肉 色Incarnadine99730.0006肉 色Incarnadine6473

续表3

TTC浓度(%)TTCconcentration菌落颜色Thecolorofthecolony菌落数Colonycount0.0008粉 色Pink88720.001粉 红Pink78740.002红 色Red81770.004红 色Red74670.006红 色Red69750.008深 红Oxbloodred77730.01紫 黑Purpleblack82660.02黑 色Black21360.03黑 色Black1070.04黑 色Black690.05黑 点Blackspot580.06黑 点Blackspot24

3 结论

3.1 在食品(或饲料)的加工、贮藏、运输过程中被污染的细菌种类很多，包括致病菌、条件性致病菌和非致病性细菌，如埃希菌属、沙门氏菌属、变形杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属等。归纳起来主要为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。本次试验选取大肠埃希菌、鼠伤寒沙门氏菌为革兰氏阴性菌代表，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌代表。

3.2 食品(或饲料)进行检测时，一些残渣微粒不可避免地被吸入，影响了细菌菌落总数的计数。添加一定浓度的TTC于平板计数琼脂培养基中，细菌在生长过程中能与其结合形成红色，残渣则保持原有的颜色，更有利于计数。TTC在使用时，应配制成溶液，4℃避光保存；TTC不耐高温，易吸潮，所以不能直接加入到培养基中灭菌；TTC溶液向培养基中添加时，培养基的温度也不宜过高，否则会使培养基变成红褐色，导致TTC失效。TTC溶液加入56℃水浴保温的培养基中，使TTC与培养基混合均匀并冷却到46℃时，再与待检样品混合，铺板，以免细菌被烫死。

3.3 使用适宜终浓度的TTC测定菌落总数时，由于菌落呈红色，与培养基颜色差别明显，与不含TTC的培养基计数相比计数方便、耗时短，提高了工作效率。贾杰[4]选0.2% TTC溶液于培养基中，采集饮用水、酒、酱油、消毒牛奶、棒冰共105份样品，利用TTC-涂抹法进行试验，结果TTC浓度为0.2%组结果优于国家标准方法，但涂抹法的缺点是加入样品量少，所造成的误差较大；王晓文等[5]用浸泡滤纸法进行抑菌试验，但纸片中TTC的量难以控制；杨庆文等[6]通过加入不同浓度的TTC得出添加0.2% TTC时为宜的结论，但TTC浓度的使用范围较窄。本实验选用平板灌注法对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌进行检测，结果显示，TTC终浓度在0.0008%～0.004%之间的平板计数琼脂培养基最佳，在该浓度下能很好地使菌落显色，同时又不会抑制细菌生长。

[1]GB4789.2-2010,食品微生物学检验[S].

[2]GB/T13093-2006,饲料中细菌总数的测定[S].

[3]郭炳才.应用TTC计数菌落的探讨[J].中国公共卫生,1999,5(4):30.

[4]贾杰.应用TTC-涂抹法测定食品中细菌总数[J].现代预防医学,2007,34(1):126-127.

[5]王晓文,张俊伟.TTC应用于食品菌落总数测定的研究[J].辽宁大学学报,2011,38(1):86-89.

[6]杨庆文,国译丹,周惠新,等.不同浓度TTC平板计数琼脂细菌生长试验观察[J].中国卫生检验杂志,2012,22(1):62-63.