反相高效液相色谱法测定茵山莲软胶囊中栀子苷含量

赵明明，宋伶俐，马楠，王东泽，王舒航，陈宇婷，金向群，路海滨

(吉林大学药学院，长春 130021)

茵山莲软胶囊作为中药复方制剂，具有清热解毒、利湿的功效，临床上用于治疗胆囊炎、胰腺炎和慢性肝炎等疾病。茵山莲软胶囊由甘草、栀子、板蓝根、半枝莲、五味子、茵陈6味中药材组成，其中，栀子苷(结构式见图1)为栀子中的有效化学成分， 具有广泛的保肝、利胆、抗炎、抗菌、抗肿瘤、降血糖方面的药理作用[1]。在已发表文献中未见有关茵山莲软胶囊含量测定报道。本实验选取栀子苷为茵山莲软胶囊的指标成分，建立了栀子苷含量的反相高效液相色谱法[2]，可用于该复方制剂的质量控制。

图1 栀子苷结构式

1 仪器与试剂

1.1 仪器

岛津LC-20AT液相色谱仪(北京谱朋科技有限公司)；N2000工作站(浙江大学智达信息有限公司)；KQ-250D数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；JT2001电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；AB204-N分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 试剂

茵山莲软胶囊(吉林省辉南三和制药有限公司，批号：20121121)；栀子苷标准品(吉林省药品生物制品鉴定所)；水为三蒸水；乙腈、甲醇(色谱级，Fisher Scientific公司)；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称取栀子苷对照品2mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀制成40μg/mL的标准溶液。

2.2 供试品溶液制备

精密称取同批次茵山莲软胶囊的内容物1.5g，放入50mL锥形瓶中，用25mL环己烷溶解，转移至分液漏斗中，再向其加入50%甲醇25mL萃取，留取甲醇层液体，重复操作2次，合并，蒸干，残渣用甲醇溶解，移至50mL的碘量瓶中，再精密加入甲醇至50mL，称定重量，在20℃下超声处理25min，放冷，再次称定重量，用纯甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 阴性对照溶液的制备

按照处方比例制备缺中药栀子的阴性样品，再按照“2.2”项的方法制成阴性对照溶液。

2.4 高效液相色谱条件

选用迪马C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以乙腈-水(V乙腈∶V水=13∶87)为流动相，检测波长238nm，进样量10μL，理论塔板数按栀子苷色谱峰计算不得低于4000。

精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μL注入高效液相色谱仪，按照上述色谱条件分析，测定的色谱峰结果显示，在供试品的色谱中，与对照品色谱相同位置上出现相同保留时间的色谱峰，且阴性溶液无干扰(图2、图3、图4)。

图2 对照品色谱图

图3 供试品色谱图

图4 阴性样品色谱图

2.5 线性关系考察

精密称取栀子苷标准品适量，配制成0.0804mg/mL的栀子苷对照品溶液，再分别精密吸取对照品1mL、2mL、4mL、6mL、8mL置于10mL碘量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得不同浓度的对照品溶液。按照“2.4”项高效液相色谱条件，精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪测定(表1)。

表1栀子苷线性测定结果

Table1Theresultforthelinearrelationshipofgeniposide

栀子苷浓度(mg/mL)Theconcentrateofgeniposide栀子苷峰面积Thepeakareaofthegeniposide0.008041061204.8750.01608259640.2500.03216522444.6250.04824807312.1250.064321061204.8750.080401344518.625

以不同栀子苷对照品质量浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，经回归计算：y=2 000 000x-3408，R2=0.9998。结果表明，栀子苷在0.008 04mg/mL～0.0804mg/mL范围内质量浓度与峰面积呈良好的线性关系(图5)。

图5 高效液相色谱法测得的栀子苷曲线图

2.6 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液10μL，连续重复进样6次，测定其峰面积，RSD为0.2637%，表明本实验方法精密度良好(表2)。

表2精密度考察

Table 2 Precision inspection

2.7 稳定性试验

精密吸取放置0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h的供试品溶液10μL，按照“2.4”项高效液相色谱条件进样分析，测定其色谱峰面积。结果表明，供试品溶液在24h内稳定，RSD为0.7755%(表3)。

表3稳定性考察

Table 3 The stability test

2.8 重复性试验

精密称取同一批次样品内容物6份，各1.5g，将其按照供试品溶液制备方法，再按“2.4”项高效液相色谱条件进样分析，样品测定结果中栀子苷含量为3.86mg(n=6)，RSD为0.7925%，表明本品的测定方法重复性良好(表4)。

表4重复性考察

Table 4 Reproducible test result

2.9 加样回收率试验

精密称定已知含量的同一批号的样品6份，再分别加入栀子苷对照品溶液适量。按“2.2”项供试品溶液制备方法操作，再按“2.4”项高效液相色谱条件进样分析，其测定结果见表5。

表5栀子苷回收率试验测定结果

Table 5 The recovery result of the geniposide

2.10茵山莲软胶囊样品中栀子苷的含量测定

取3批供试样品，按“2.2”项制备供试品，精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL，分别注入高效液相色谱仪测定分析，记录峰面积，采用外标法计算栀子苷的含量(每粒软胶囊重0.5g)，测定的3批样品结果见表6。

表6茵山莲软胶囊中栀子苷的含量测定结果

Table6ThequantitativedeterminationofgeniposideofYinshanliansoftcapsules

编号NO栀子苷含量(mg/粒)Thecontentofgeniposide11.26121.28231.271平均 Average1.268

3 讨论

3.1 萃取溶剂的选择

在供试品制备时，本试验选取单因素考察法，以栀子苷含量为指标，对萃取液中甲醇的用量、甲醇的浓度还有萃取时间3个因素进行了考察，结果表明，栀子苷的最佳提取条件是25mL的50%甲醇萃取30min。

3.2 测定方法的选择

栀子苷的主要测定方法有薄层扫描法、紫外法和反向高效液相色谱法[3，4]。本研究中选用了反向高效液相色谱法测定栀子苷含量，通过筛选多种流动相系统，最终采取了本实验的高效液相色谱条件，使得栀子苷与其他成分的色谱峰完全分离了，同时该分析方法还具有简单准确、灵敏度高的特点，可作为茵山莲软胶囊的质量控制方法。

[1]张玲,孙科.栀子苷的药理活性与结构改造的研究进展[J].齐鲁药事,2011,9(1):530-531.

[2]黄群莲,唐灿,张彦燕.高效液相色谱法测定江津栀子中栀子苷含量[J].药物鉴定,2011,20(11):21-22.

[3]万军.高效液相色谱法测定鼻渊舒颗粒中栀子苷的含量[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(19):79-80.

[4]蒲艳春,徐艳丽,崔静茹.正交设计法优选栀子苷提取工艺[J].中华中医药学刊,2012,30(5):1029-1030.