粒毛盘菌DP5胞外多酚的提取及抗氧化活性研究

曹焕英，孙丹宇，杨 柳，钱 潇，牛兆众

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥 230009)



粒毛盘菌DP5胞外多酚的提取及抗氧化活性研究

曹焕英，孙丹宇，杨 柳*，钱 潇，牛兆众

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥 230009)

[目的]使用树脂对粒毛盘菌DP5胞外多酚进行提取，并且对其体外抗氧化活性进行评价。[方法]以多酚得率为指标，优化粒毛盘菌DP5胞外多酚的提取工艺。[结果]以大孔树脂X-5为填充料，进样浓度为0.64 mg/ml，进样流速为1 ml/min，洗脱溶剂为浓度80%的乙醇，洗脱流速为1 ml/min，粒毛盘菌胞外多酚含量为815.7 mg GAE/g。体外抗氧化试验表明，粒毛盘菌DP5胞外多酚具有还原力和清除DPPH自由基、羟自由基(·OH)、亚硝酸盐(NO2-)的效果，且随着多酚浓度的升高其活性增强。[结论]该研究结果为粒毛盘菌多酚的开发利用提供理论依据。

粒毛盘菌;胞外多酚;提取;抗氧化活性

多酚是苯环上联有多个羟基的化合物的总称。多酚特有的化学结构赋予其良好的抗氧化活性。多酚是植物体内的重要次生代谢产物，广泛存在于植物的皮、根、叶、果。多酚也可由桦褐孔菌、盘龙参内生真菌等发酵获得。真菌多酚具有较强的自由基清除能力[1-3]。

粒毛盘菌属(Lachnum)是一类具有重要应用价值的真菌，在深层发酵条件下可以产生多糖、黑色素、多酚等生物活性物质[4-6]。目前，关于粒毛盘菌胞外多酚的纯化与活性的研究报道较少。笔者将粒毛盘菌DP5胞外多酚进行纯化，并对纯化后的多酚进行抗氧化活性的测定，为粒毛盘菌胞外多酚的研究提供一定的科学基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试菌种为粒毛盘菌DP5菌株。子实体采集自中国云南省，由合肥工业大学微生物资源与应用研究室分离、保藏。

1.2 试验方法

1.2.1 多酚粗提液的制备。取粒毛盘菌发酵液，醇沉，离心除多糖、蛋白，有机溶剂脱曲酸，离子交换树脂脱氨基酸，浓缩得多酚粗提液。

取发酵液，按体积比1∶1加入无水乙醇，4 ℃静置过夜，进行醇沉脱蛋白、多糖等杂质，离心，取上清液进行浓缩，将浓缩液置于冰箱，4 ℃静置24 h，脱掉部分曲酸，用乙酸乙酯萃取，除掉剩余曲酸，过通用性阳离子交换树脂脱掉氨基酸和部分还原糖，收集滤液，得多酚粗提液。

1.2.2 多酚的测定(普鲁士蓝法)。采取Martin L.的方法进行适当修改[7]。取适当稀释的待测液l ml于25 ml比色管中，加入1 ml 0.1 mol/L 氯化铁溶液、1 ml 0.008 mol/L铁氰化钾溶液，混匀，30 ℃保温15 min，定容至25 ml，摇匀，用紫外分光光度计在700 nm下测定OD值。以没食子酸为标准品，测定标准曲线。

1.2.3 柱层析试验。分别选用不同型号的大孔树脂和硅胶作为柱层析填充料，进行静态吸附与解吸试验，选择合适的树脂或硅胶作为柱层析的填充料。通过动态吸附与解吸试验，确认最佳上样浓度、上样流速、洗脱溶剂、洗脱流速。

1.2.4 多酚的体外抗氧化活性分析。

1.2.4.1 还原力的测定。参考Lillian等[8]方法，取2.5 ml样液于试管中，加入2.5 ml 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液(pH 6.6)和2.5 ml浓度1%铁氰化钾溶液，50 ℃水浴20 min，取出后冷却，再加入浓度10%三氯乙酸2.5 ml，摇匀，终止反应。取该溶液5 ml，加入4 ml蒸馏水和1 ml浓度0.1% FeCl3溶液，混匀，静置15 min，在700 nm处测吸光值。吸光值越大，说明溶液的还原能力越强。

1.2.4.2 多酚提取样对NO2-的清除效果。取2 ml亚硝酸钠溶液(5 mg/L)于25 ml比色管中，加入3 ml样品溶液，混匀，常温下反应30 min，加入0.5 ml浓度0.2%盐酸萘乙二胺溶液，加水定容至25 ml，摇匀，静置15 min，在538 nm处测定吸光值。多酚对亚硝酸盐(NO2-)的清除率公式为：

NO2-清除率(%)=100%×[A0-(A2-A1)]/A0

式中，A0为空白对照的吸光度；A1为样品溶液的吸光度；A2为样品溶液加入亚硝酸钠反应后的吸光度。

1.2.4.3 多酚提取样对羟自由基(·OH)的清除效果。参考Wang等[9]的方法，并略作修改,取2 ml样液于试管中，加入2 ml 9 mmol/L FeSO4溶液和2 ml 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，充分混匀后，加入2 ml 8.8 mmol/LH2O2溶液，混匀，37 ℃下反应30 min，510 nm处测定吸光值。空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品溶液及8.8 mmol/L H2O2溶液。多酚对·OH的消除率公式为：

·OH消除率(%)=100%×[A0-(A2-A1)]/A0

式中，A0为空白对照的吸光度；A1为样品溶液的吸光度；A2为样品溶液加入H2O2溶液反应后吸光度。

1.2.4.4 多酚提取样对DPPH自由基的清除效果。取一定浓度的多酚溶液4 ml于试管中，加入1 ml 1 mmol/L无水乙醇配制的DPPH自由基溶液，振荡混匀后避光静置30 min，于517 nm处测定吸光值，计算多酚对DPPH的清除率，以VC为阳性对照。

DPPH清除率(%)=100%×[A0-(A2-A1)]/A0

式中，A0为DPPH和水的吸光度；A1为样品溶液的吸光度；A2为样品溶液加入DPPH反应后吸光度。

2 结果与分析

2.1 柱层析试验

2.1.1 不同树脂对粒毛盘菌胞外多酚(LEP)吸附与解析的影响。分别选用大孔树脂D1300、D101、X-5、AB-8、D201、D70和硅胶，进行静态吸附与解吸试验。由表1可知，大孔树脂X-5的吸附与解吸效果最佳。选择大孔树脂X-5作为柱层析的填充料进行后续研究。

表1 不同大孔树脂与硅胶树脂对粒毛盘菌胞外多酚吸附与解析的影响

2.1.2 动态吸附与解吸试验。

2.1.2.1 进样浓度与进样流速的选择。进样浓度设为0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 mg/ml，上样流速设为0.5、1.0、1.5、2.0和3.0 ml/min，收集流出液，测定粒毛盘菌胞外多酚含量，计算树脂的动态吸附量。

由图1和图2可知，以不同浓度多酚溶液进样，当多酚浓度低于0.64 mg/ml时，随着多酚浓度的提高，多酚吸附率随之增大，而当继续增加多酚浓度时，多酚吸附率基本达到平衡，吸附率不再增加。因此，选择进样浓度为0.64 mg/ml。随着进样流速的增大，多酚的吸附率呈下降趋势，在进样液流速为0.5 ml/min时多酚的吸附率最高，但是进样时间较长。经综合考虑，选择进样流速为1 ml/min。

2.1.2.2 洗脱剂种类的选择。洗脱剂分别为乙醚、乙酸乙酯、甲醇以及浓度50%、80%、100%乙醇。由图3可知，浓度50%乙醇对多酚的解吸效果最佳，但是由于其水含量较高，洗脱的杂质也较多。经综合考虑，选择浓度80%乙醇进行洗脱。

2.1.2.3 洗脱流速的选择。分别以0.5、1.0、1.5和2.0 ml/min的流速洗脱，以1 BV为1单位收集流出液，测定多酚含量，绘制洗脱曲线。由图4可知，当洗脱剂的流速较小时，洗脱峰较早出现，且较集中，峰也越高，拖尾现象越不明显，所以洗脱流速越小，洗脱效果越好。经综合考虑，选择洗脱速率为1 ml/min。

2.1.3 验证试验。将多酚提取液用大孔树脂X-5进行吸附，进样浓度为0.64 mg/ml，进样流速为1 ml/min，洗脱溶剂为浓度80%乙醇，洗脱流速为1 ml/min，收集解吸液，浓缩后冷冻、干燥，得固体。经测定，粒毛盘菌胞外多酚的含量由432.7 mg GAE/g提高到815.7 mg GAE/g。

2.2 粒毛盘菌的生物活性试验 生物活性物质的抗氧化性与其还原力有一定的关系。还原力越强，其抗氧化活性越高[10-11]。由图5可知，粒毛盘菌DP5胞外多酚的还原力随着多酚浓度的提高，其还原力增强，与VC的还原力相差不大。粒毛盘菌胞外多酚具有一定的抗氧化能力。

由图6可知，粒毛盘菌DP5胞外多酚对DPPH自由基的清除效果高于VC，且随着多酚浓度的升高，其清除率增加。当多酚浓度为0.15 mg GAE/ml，VC浓度为0.15 mg/ml时，多酚对DPPH自由基的清除率是VC的2倍。由此可知，粒毛盘菌DP5胞外多酚具有较强的DPPH自由基清除效果。

NO2-是亚硝胺的前体物质。亚硝胺是人体内的强致癌物。通过消除体内的NO2-，可以降低癌症发病率[12]。由图7可知，粒毛盘菌DP5胞外多酚对NO2-的清除效果明显，当多酚浓度达到0.2 mg GAE/ml时对NO2-的清除率达到50%。

羟基自由基是目前所知活性氧自由基中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基。它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化损伤，使得细胞坏死或突变[13]。由图8可知，粒毛盘菌DP5胞外多酚对·OH自由基具有一定的清除效果。

3 结论

采用柱层析的方法，对粒毛盘菌DP5胞外多酚进行纯化。选用X-5大孔树脂作为柱层析的填充料，并且对其上样浓度、上样流速、洗脱溶剂和洗脱流速进行研究，得出最合适的条件，使得粒毛盘菌胞外多酚含量由432.7 mg GAE/g提高到815.7 mg GAE/g，并且对其生物活性进行研究。研究表明，粒毛盘菌DP5胞外多酚对DPPH、NO2-和·OH均有消除效果，且均有还原力。

[1] 高宁，毕珊珊，胡凤，等．盘龙参内生真菌抑菌活性的初步研究[J]．广东药学院学报，2011，27(4)：367-370.

[2] 朱金卫，徐向群．桦褐孔菌多酚的液体深层制备及抗氧化活性研究[J]．浙江理工大学学报，2011，28(5):616-620．

[3] 高雪丽，高愿军，李建光，等．桦褐孔菌多酚对食用油脂的抗氧化效果[J]．食品工业科技，2008，29(1)：135-137．

[4] YE M,QIU T,PENG W,et al.Purification,characterization and hypoglycemic activity of extracellular polysaccharides fromLachnumcalyculiforme[J].Carbohydrate Polymers,2011,86(1):285-290.

[5] YE M,WANG Y,GUO G Y,et al.Physicochemical characteristics and antioxidant activity of arginine-modified melanin fromLachnumYM-346[J].Food Chemistry,2012,135(4):2490-2497.

[6] 叶明，朱立．辛格粒毛盘菌胞内多酚提取及其抗氧化性研究[J]．食品科学，2008，29(8)：249-252．

[7] PRICE M L,BUTLER L G.Rapid visual estimation and spectrophotometric determination of tannin content of sorghum Grain[J].Agric Food Chem,1977,25(6):1268-1273.

[8] LILLIAN B,SORAIA F,PAULA B,et al.Antioxidant activity ofAgaricussp.mushrooms by chemical,biochemical and electrochemical assays[J].Food Chemistry,2008,111(1):61-66.

[9] WANG H Y,JIANG X L,MU H J,et al.Structure and protective effect of exopolysaccharide fromP.Agglomeransstrain KFS-9 against UV radiation[J].Microbiological Research,2007,162(2):124-129.

[10] SHON M Y,KIM T H,SUNG N J.Antioxidants and free radical scavenging activity ofPhellinusbaumii(PhellinusofHymenoehaetaceae) extracts[J].Food Chemistry,2003,82(4):593-597.

[11] DORMAN H J D,KOSAR M,KAHLOS K,et al.Antioxidant properties and composition of aqueous extracts fromMenthaspecies,hybrids,varieties,and cultivars[J].Journal of Agricultural Food Chemistry,2003,51(6):4563-4569.

[12] 于淑池，侯金鑫．龙井茶多糖对自由基和NO2-清除作用研究[J]．食品研究与开发，2012，3(4)：28-31．

[13] 回晶，李其久，边媛媛，等．桑黄总黄酮超声提取工艺及其生物活性研究[J]．食品科学，2010，31(24)：195-198．

ExtractionandAntioxidant Activity of Extracellular Polyphenols fromLachnumDP5

CAO Huan-ying, SUN Dan-yu, YANG Liu*et al

(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei, Anhui 230009)

[Objective] The study was to optimize the extraction process of the extracellular polyphenols fromLachnumDP5 (LEP) using resin, and investigate its antioxidant activitiesinvitro.[Method] LEP were extracted and optimal conditions were investigated using single factor experiments. [Result] Macroporous resin X-5 was selected and the extraction conditions were as following: sample concentration of 0.64 mg/ml, the injection flow rate of 1 ml/min, elution solvent of 80% ethanol, the elution flow rate of 1 ml/min. The contend of LEP reached 815.7 mgGAE/g under the optimal conditions. Antioxidant activity analysisin vitro for LEP extraction indicated that the LEP have the ability to scavengingfree radical of DPPH,hydroxyl, NO2-and restoring and the activity was related to its concentrations. [Conclusion]This study was aimed to provide theoretical basis for the development and utilization of LEP.

Lachnum;Extracellular polyphenol; Extraction;Antioxidant activities

合肥工业大学大学生创新创业训练计划项目(2014CX-CYZ041)。

曹焕英(1989-)，女，山东潍坊人，硕士研究生，研究方向：真菌活性物质。*通讯作者，副教授，博士，从事应用微生物方面的研究。

2015-04-20

S 509.9

A

0517-6611(2015)17-012-03