油菜细胞质雄性不育与育性恢复机理的研究进展

刘琪迩 杜坤 王幼平

（扬州大学生物科学与技术学院，扬州　225009）

油菜细胞质雄性不育与育性恢复机理的研究进展

刘琪迩 杜坤 王幼平

（扬州大学生物科学与技术学院，扬州225009）

油菜细胞质雄性不育不仅是研究核质互作的理想材料，同时也是杂种优势利用的最有效方式之一。目前对油菜细胞质雄性不育的研究主要包括不育基因的来源、不育基因的结构特征、不育基因的作用机理以及育性恢复的分子机制等。对目前国际上主要的油菜细胞质雄性不育类型（pol CMS、nap CMS、kos CMS、ogu CMS和tour CMS）在分子水平上的研究进展进行了综述。包括线粒体不育基因相关区域的确定和结构特点，不育形成的分子机理以及恢复基因的定位和作用机制等。

油菜；细胞质雄性不育；恢复基因

细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）是油菜杂种优势利用的重要途径，与化学去雄、细胞核雄性不育、自交不亲和等方式相比较，CMS是最为理想的授粉控制系统之一。目前国内外已研究报道过的油菜CMS主要类型有：波里马胞质雄性不育系（pol CMS）、nap胞质雄性不育系（nap CMS）、萝卜胞质雄性不育系（ogu CMS）、tour胞质雄性不育系（tour CMS）、Kosena胞质雄性不育系（kos CMS）、hau胞质雄性不育系（hau CMS）等。植物细胞质雄性不育主要与线粒体基因组有关，植物的线粒体基因组不仅有其独立的遗传系统，而且由于存在高度重组和外源DNA整合的特性，使线粒体基因组更为复杂。与CMS相关不育基因的研究主要是通过线粒体DNA（mt DNA）的限制性内切酶酶切片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）来研究线粒体不育基因的类型；也可以利用比较物理图谱的方法来分析线粒体基因组结构上的差异，从而进一步确认与不育相关的基因。本文对目前国际上主要的油菜细胞质雄性不育类型的不育分子机理研究进展进行了综述。

1 油菜细胞质雄性不育类型以及不育相关基因区域

pol CMS：pol CMS是傅廷栋教授于1972年在甘蓝型油菜品种“波里马”中首次发现的天然细胞质雄性不育类型［1］。目前，在我国pol CMS被广泛用于制备油菜杂交种［2］。早在1986年Erickson［3］就利用RFLP的方法比较了pol CMS和cam胞质的mt DNA，限制性酶切片段表明两者存在明显的差异。Singh和Brown［4］通过对nap胞质的甘蓝型油菜保持系、pol CMS和恢复系中14个线粒体基因转录产物研究时发现，仅在atp6基因区域处存在差异。atp6基因在pol CMS中有2.2 kb和1.9 kb的转录本，在nap CMS中仅转录产生1.1 kb的转录本，而在育性恢复后代中，该1.1 kb的转录本显著上升，并且伴随1.3 kb和1.4 kb两个新转录本的产生，后经证实可能是恢复基因对线粒体不育相关区域的调控作用［5］。通过序列分析发现在pol CMS的atp6基因上游由于线粒体基因组的重排产生了一个编码224个氨基酸的嵌合式开放阅读框orf224，与atp6基因共转录形成pol CMS的不育相关基因［6］。L'Homme 和Brown［7］在比较甘蓝型油菜cam胞质可育系和pol CMS植株mt DNA物理图谱时发现，两者差异仅发生在atp6基因上游区域。在pol CMS中，该区域含有orf224并与atp6基因共转录，证实了orf224/atp6与pol CMS的相关性。Wang等［8］对甘蓝型油菜pol CMS与花椰菜体细胞杂种后代中不育植株的mt DNA进行分析，结果表明不育胞质杂种都存在orf224/ atp6共转录本，与pol CMS不育性状紧密连锁，进一步证实了orf224/atp6与pol CMS不育性状是高度连锁的。

nap CMS：Thompson［9］于1972年在波兰春油菜品种Bronowski（父本）与冬油菜品种RD58（母本）杂交F2代中发现了细胞质雄性不育植株，利用此雄性不育株与Bronowski回交选育出T CMS。而Shiga和Baba［10］从日本甘蓝型油菜品种千荚油菜（母本）和北陆23（父本）的杂交后代中也发现了细胞质雄性不育植株，将这种不育胞质称为S CMS。进一步研究证明T CMS和S CMS属于同一类型，合称nap CMS。1996年，L'Homme发现，pol CMS中的4.5 kb大小atp6/orf224转录本在cam胞质中不存在，但却位于nap CMS的 mt DNA上不同区域。该片段内存在一个与orf224相似的orf222，与orf224有85%的序列相似性，有6个碱基的插入或缺失突变，其5'端也同样来自orfB。通过预测得知orf222可以编码产生一个26 kD的内在膜蛋白，与orf224的预测产物有79%的同源性，具有极其相似的亲水性结构。且该片段位于nad5基因（编码NADH脱氢酶复合体的一个亚基）第3个外显子C端上游300 bp的位置，并与另一个功能未知阅读框orf139共转录。利用特异引物对orf222进行Northern Blot分析发现，只在nap CMS和nap胞质恢复系中有2.0 kb和1.7kb大小的转录本，且nap CMS中orf222的转录本要远远丰富于nap胞质的恢复系。利用21个线粒体基因探针对nap CMS、nap恢复系和cam胞质的保持系进行Northern分析时发现只有orf222/nad5c/orf139区域转录本存在差异，证明了该区域与nap CMS有关［11］。

ogu CMS：是Ogura［12］首次在萝卜中发现的天然雄性不育类型。1977年，Bannerot通过种间杂交和连续回交将甘蓝型油菜的核导入萝卜的ogu CMS中，得到了甘蓝型油菜ogu CMS。其不育性状十分稳定，自然存在的油菜大多都是其保持系［13］。目前ogu CMS是北美及欧洲等地主要应用于生产油菜杂交种的细胞质雄性不育类型。Bonhomme等［14］对ogu CMS的mt DNA进行序列分析时发现一段包含orf138、orf158和一个tRNA基因（trnfM）的区域，该区域可能与雄性不育相关。orf138位于orf158（能够编码ATP合酶的8个亚基）的上游与之共转录，产生一个1.4 kb的转录本。其中orf158在正常胞质中也转录，而orf138只在ogu CMS中转录。在对orf138序列同源性进行分析时发现，包括orf138编码区12个密码子和3'侧翼序列在内的70个氨基酸与拟南芥中可能为NADH脱氢酶编码的orf557的3'非翻译区相同［15，16］。Duroc等［17］发现在ogu CMS中，orf138编码一个膜结合蛋白，该蛋白与线粒体内膜相连，分子量为22 kD，易形成寡聚体。将其在大肠杆菌中表达，能够抑制大肠杆菌的正常生长，说明ORF138对细胞具有毒害作用。通过构建orf138与绿色荧光蛋白GFP融合的靶向线粒体表达载体，将该基因的表达载体导入酵母和拟南芥中，来研究不育蛋白的结构与雄性不育关系的机制时发现，ORF138蛋白并没有抑制酵母的生长，却改变了酵母和植物细胞中的线粒体的外形，转基因的拟南芥也没有出现不育的性状［18］。这可能与核表达的ORF138亚细胞定位有关。

kos CMS：Sakai等［19］利用另一种来源于萝卜的胞质不育类型kos CMS，通过原生质体融合技术将该胞质不育转入B. napus［19，20］。在对萝卜kos CMS线粒体DNA进行分析时发现了一个与CMS相关的基因orf125，该基因序列与ogu CMS不育基因orf138有较高的同源性，只存在2个氨基酸替换和39 bp处一个碱基缺失。在萝卜kos CMS中orf 125与orfB共转录。然而在甘蓝型油菜kos CMS中orf125的3'侧翼区域出现了一个新的mt DNA序列。orf 125在两种胞质的CMS中都可以表达出蛋白，且育性恢复植株中ORF125含量显著降低［21］。

tour CMS：tour CMS是 印 度 学 者Rawat和Anand［22］于1979年在芥菜型油菜中发现的天然细胞质雄性不育材料，Pradhan等证实该不育材料的细胞质来源于非洲芥菜B. tournefortii，属异源细胞质雄性不育［23，24］，目前这种不育胞质在印度得到应用。Landgren等［25］研究表明，tour CMS线粒体基因atp6存在两个大小分别为2.3 kb和1.1 kb的转录本。其中2.3 kb的转录本中除了含有正常的atp6基因外，在其下游还含有一个异常的orf263。该2.3 kb的转录本与可育性状共分离。在利用SDS-PAGE分析不育系、保持系和恢复系的线粒体总蛋白差异时发现，存在有3个差异条带分别是32 kD、29 kD和20.5 kD，其中20.5 kD与细胞质的来源有关。32 kD的蛋白质只存在于不育系中，而29 kD的蛋白在可育和育性恢复系中不存在或存在量很少［25］。

hau CMS：hau CMS是傅廷栋教授于1999年在芥菜型油菜中发现的自发突变的细胞质雄性不育系。目前已经利用回交的方法将该不育胞质转移到甘蓝型油菜中去。Wan等［26］利用16个线粒体探针和酶切组合将hau CMS与其他4种CMS（pol CMS、nap CMS、ogu CMS、tour CMS）区分开来，证明hau CMS是一种新型的油菜细胞质雄性不育类型。借助hau CMS和保持系的多代回交的材料进行线粒体基因差异表达分析发现，一个位于atp6基因下游，并与它共转录的新型开放阅读框orf288可能是hau CMS雄性不育相关的基因。利用Western blotting方法分析得出在雄性不育系中orf288能够翻译成蛋白质。将orf288导入大肠杆菌中并表达发现，ORF288明显抑制大肠杆菌的生长，暗示该蛋白对大肠杆菌有毒害作用，而且在有无线粒体靶向前导序列存在时orf288都能够造成转基因拟南芥花粉败育［27］。结果表明orf288是造成hau CMS的相关基因。orf288与tour CMS的不育基因orf263高度同源，可能是由于orf263中碱基置换和碱基缺失导致的阅读框延长所致［28］。

Nsa CMS：Nsa CMS是胡琼（Hu）等［29］利用甘蓝型油菜中双4号与新疆野芥通过原生质体融合获得的体细胞杂种，以后代中雄性不育株做母本，中双4号做轮回亲本回交多代创建的异源细胞质雄性不育系［29-31］。在利用反向斑点杂交鉴定Nsa CMS相关基因时发现，nad2基因在Nsa CMS中的杂交信号弱于保持系，说明在不育系中nad2基因表达受到抑制，推测nad2可能与Nsa CMS相关。

除此之外，目前报道的其他油菜CMS类型有：利用远源杂交从甘蓝型油菜与埃塞俄比亚芥杂交后代中选育出的NCa CMS［30］；印度的Parkash和Bhat等［31］利用体细胞融合和有性杂交技术获得的芥菜型油菜Mor CMS。李殿荣等［32］从复式杂交后代中选育的Shan 2A；还有本实验室通过甘蓝型油菜与白芥电融合，从杂种后代中选育出的细胞质雄性不育材料SaNa-1A等［33］。

综上所述，线粒体雄性不育基因通常具有下列特点：常与atp6、atp8或atp9等功能基因嵌合并共转录，油菜CMS主要属于这种类型。此外，大部分的不育基因中都含有与已知的线粒体功能基因相似的片段（频繁重组所致），部分不育基因含有跨膜结构。如ogu CMS中的orf138是线粒体基因组小的同源区域之间重新组合形成的。

2 不育基因的作用机理

pol CMS中的orf224造成不育的原因有两种假说：一是认为orf224与atp6基因共转录，减少了正常atp6基因转录从而降低ATP合酶亚基的蛋白量，造成线粒体能量供应异常，从而引起花粉败育。二是认为orf224可能产生出一种毒蛋白，引起不育。赵敏荣等［34］将扩增出的orf224基因片段在大肠杆菌中表达，并未检测出ORF224蛋白，但发现经诱导后的重组菌株的生长受到抑制，利用特异性抗体可以检测到orf224基因表达产物，对细菌生长具有抑制或毒害作用。最近，通过对pol CMS近等基因系可育和不育花蕾转录组差异的比较，结果表明有1 148个unigene表达水平明显改变，这些基因主要是代谢和蛋白合成通路相关基因，一些控制花粉囊发育的unigene在不育系中明显下调。推测orf224/ atp6造成的能量缺乏可能是由于一些线粒体基因与核基因的相互作用抑制了一些调控花粉发育的基因的表达；由于缺乏ATP合酶亚基蛋白，造成的能量缺乏，会导致pol CMS雄性不育系中造孢细胞不能正常分化，最终造成花粉败育［35］。与pol CMS不育形成机理相似，nap CMS也可能是orf222与邻近的atp6基因共转录，造成atp6基因单顺反子转录本减少，从而减少了atp6基因编码的蛋白量，致使nap CMS线粒体的功能异常，能量供应不足，导致不育。Dong等［36］利用基因芯片对白菜型油菜ogu CMS和保持系花蕾进行转录模式分析时发现，在不育系中特异表达基因包括胁迫相关和氧化还原相关的基因，一些与花粉外壁形成以及花粉萌发相关基因在不育系中表达被抑制，而与生长素、ATP合成、花粉发育和应激相关的核基因表达发生延迟。对Nsa CMS与其恢复系NR1杂交产生的可育和不育后代的幼嫩花蕾转录组分析发现，在可育后代中检测到更多的特异表达基因，主要是一些花粉壁装配相关基因；在不育后代中发现了11个与柠檬酸循环有关基因、ATP合酶相关基因、氧化还原酶相关基因显著下调，除此之外许多有关戊糖磷酸途径、糖代谢途径、碳固定基因表达模式也发生了改变［37］。

目前关于线粒体基因调控核基因表达的了解还不多，而细胞质雄性不育是研究核质互作的重要材料。Yang等［38］利用芥菜型油菜不育系来研究逆行调控时发现，一个在不育系和保持系中差异表达的线粒体基因BjRCE1能够逆行调控生长素应答的相关基因的表达，造成生长素应答通路的改变。为了研究miRNA的作用与芥菜型油菜不育系花粉败育和花器官的畸形发育之间关系，Yang等［39］建立了芥菜型油菜不育系中由miRNA介导的核质互作模型。发现47个miRNA在不育和保持系中差异表达，降解组分析显示miRNA靶基因包括生长素应答因子，NAC转录因子，GRAS家族转录因子，MYB转录因子等在基因调控中扮演了重要角色。目前也有研究者利用甲基化敏感多态性扩增（Methylation sensitive amplymorphism，MSAP）研究不育和可育胞质与DNA甲基化的关系发现，核基因的甲基化明显受到雄性不育胞质的影响［40］。

在植物线粒体基因组中与CMS相关的ORF是如何导致线粒体功能丧失的机制还不清楚。有可能是新的ORF导致线粒体能量供给不足，也有可能是CMS蛋白毒性会导致花粉败育，但均没有直接证据，相关的研究有待进一步深入。

3 油菜细胞质雄性不育恢复基因及作用机理

油菜细胞质雄性不育恢复基因的定位是近年来研究的热点。目前对于恢复基因的研究主要利用分子标记技术和连锁图谱，包括RFLP、RAPD、AFLP和SSR进行定位，恢复基因的作用机制主要从影响CMS相关基因的转录、影响CMS相关基因转录本的加工编辑以及影响转录本的翻译来实现的。

pol CMS的恢复基因主要存在于欧洲甘蓝型油菜品种中，位于A基因组染色体上［41］。遗传分析证明pol CMS的育性恢复基因（Rfp）是显性单基因［42，43］。也有人认为pol CMS恢复基因由2对主效基因Rfp1和Rfp2控制，均被定位在第18条染色体上［44］。Yuan等［45］利用10个线粒体基因探针对pol CMS、恢复系和保持系的花蕾线粒体进行Northern检测发现，在恢复系中由于Rfp基因的存在可能使得不育系中2.2 kb和1.9 kb转录本发生降解产生2个新的转录本，即orf224/atp6转录可由核恢复基因来调控。Li等［46］发现nap CMS的核恢复基因（Rfn）与Rfp基因是等位基因，两者都能通过除去转录本5'端序列来影响不育基因的表达［5，47］。

核恢复基因的研究主要集中在筛选和创建与Rfp位点连锁的分子标记［48］。Liu等［49］在Zhao［50］创建的2个SCAR 标记和B. napus与芸薹属其他种的同线性区域基础上，将Rfp基因定位到B. rapa基因组29.2 kb区域上。在此区域内包含7个开放式阅读框，其中ORF2编码一个PPR蛋白，成为Rfp最有可能的候选基因［49］。PPR蛋白是一种RNA结合蛋白，由35个氨基酸串联重复组成，目前已知该蛋白在线粒体和叶绿体内转录后编辑修饰的过程中起重要作用［51，52］。这种PPR蛋白可能在转录后水平影响不育相关区域转录本的加工编辑，编辑过的RNA能够翻译出正常的蛋白质，从而引起育性恢复。Krishnasamy等和Bellaoui等［53，54］在对ogu CMS的育性恢复系中ORF138蛋白表达水平研究发现由于核恢复基因（Rfo）的存在使得ORF138蛋白的积累明显减少但是对orf138转录本的大小、丰度或RNA的编辑模式没有影响。Brown等和Desloire等［55，56］通过对拟南芥和萝卜的微共线性分析，结合图位克隆方法克隆Rfo基因，将Rfo定位到萝卜染色体22 kb左右的区域，该区域包含3个PPR蛋白基因（PPR-A、PPR-B、PPR-C）。Uyttewaal等［57］证实了PPR-B在恢复育性时的主要作用就是抑制ORF138蛋白在绒毡层内的化学合成。但PPR-B蛋白不能影响orf138基因的mRNA的积累。最终离体免疫沉淀反应证实了PPR-B能够直接或间接的与orf138的RNA相互作用，这些证据都支持PPR-B在orf138转录后调控起关键作用。Qin等［58］通过比较rfo/rfo和Rfo/Rfo纯合子植株的转录本序列时发现Rfo的等位基因PPR-A带有4个相同氨基酸的缺失，在Rfo蛋白的中心区域的这4个氨基酸删除，发现其育性恢复能力降低，揭示了ogu CMS中的Rfo一级结构和生物学功能之间的关系。在ogu CMS油菜中也常发现育性自然恢复现象，ogu CMS的育性恢复突变株可能是含有orf138基因的优势片段超过临界值的结果［16］。ogu CMS的不育性十分稳定，但是其育性恢复基因仅存在于萝卜基因组中，难以直接利用，所以转育萝卜恢复基因是实现甘蓝型油菜ogu CMS应用的关键。法国等一些欧洲国家已经实现ogu CMS的三系配套并拥有各自的品种专利权，而我国还没有对ogu CMS进行大规模的利用，陈卫江等［59］创制了甘蓝型油菜ogu CMS恢复材料CLR650。前期研究结果表明，在油菜pol CMS、nap CMS、ogu CMS中的恢复基因Rfp、Rfn、Rfo不会阻止不育基因的转录，反而影响转录后或翻译水平上的调控，使得不育基因的表达受到抑制，从而恢复其育性。

来自不同胞质的核恢复基因可以具有共同生物学功能。例如，在芥菜型油菜4种CMS系中具有相同的不育基因（orf108），并且分享共同的恢复基因。研究发现，含有orf108/atpA的双顺反子序列将orf108转入拟南芥中会出现50%的不育花粉，这暗示着orf108在配子体阶段具有致死性。orf108广泛分布在芸薹属植物的各种野生近缘物种中，这也首次展示了不同来源和不同形态CMS可以具有相同的分子基础［60］。

Koizuka等［61］研究发现两个显性等位基因Rf1和Rf2共同控制kos CMS的育性恢复。恢复基因Rf1在翻译水平或翻译后水平调控ORF125蛋白的积累，并与Rf2相互作用从而使育性得到恢复。为了鉴定Rf基因，日本学者将含有关键基因的质粒转入甘蓝型油菜观察育性恢复情况时发现，一个4.7 kb大小的Bam H I/Hpa I酶切片段能够恢复kos CMS育性。该片段中包含一个编码687个氨基酸的orf687和16个重复的PPR基序。在不育系中orf687的等位基因的第3和第4个重复PPR序列中有4个氨基酸的替换，并推测ORF687可能直接或间接的降低ORF125蛋白水平，从而使不育植株恢复育性［62］。此外，Janeja［63］在寻找tour CMS的恢复基因时也发现有两个核恢复基因，一个主效基因（Rft1）和次效基因（Rft2）共同恢复不育系的育性。Rft1基因可以完全恢复育性，而Rf2只能部分恢复育性；并且筛选了5种AFLP分子标记，其中EACC/MCTT105，EAAG/MCTC80是Rft1的翼侧标记。

4 结语

植物细胞质雄性不育具有极高利用价值的生物学特征，它的形成机制复杂，涉及到核质互作、基因表达调控和环境等各种因素的影响。目前关于其不育机理的研究主要集中在mt DNA上的一些异常开放式阅读框，但是这些基因表达出的蛋白质究竟有哪些功能，如何引起雄性不育的还不清楚。对于油菜细胞质雄性不育基因的研究首先是确定不育基因，克隆不育基因将其在原核生物中表达，分析表达蛋白的功能特性，其次构建线粒体定位的器官特异表达载体，鉴定转基因植株的育性情况。而对育性恢复基因进行分析时应先将其在物理图谱上定位，再精细定位、克隆恢复基因，再研究恢复基因对不育基因的调控作用。

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（责任编辑 狄艳红）

Research Progress on M echanism s of Cytop lasm ic M ale Sterility and Fertility Restoration in Rapeseed

Liu Qi’er Du Kun Wang Youping
（College of Bioscience and Biotechnology，Yangzhou University，Yangzhou225009）

Cytoplasmic male sterility（CMS）is an ideal material to study nuclear-cytoplasm interactions， meanwhile it is one of the most effective ways to use heterosis. The researches related to rapeseed CMS in recent years focused on the analysis of structure characteristics and origins of the sterility genes， the mechanism of sterility gene and the restoration of fertility. This paper introduced the current international main types of CMS（pol CMS， nap CMS， kos CMS， ogu CMS and tour CMS）in rapeseed， and also reviewed the research progress of molecular level，including the identification of CMS-associated regions， the possible mechanism of CMS and the localization of restorer genes.

rapeseed；cytoplasmic male sterility（CMS）；restorer gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.004

2015-01-24

高等学校博士学科点专项科研基金（20123250110009），国家自然科学基金项目（31571699）

刘琪迩，女，硕士研究生，研究方向：油菜遗传育种；E-mail：376962496@qq.com

王幼平，男，教授，研究方向：油菜遗传育种；E-mail：wangyp@yzu.edu.cn