污白干酪菌核糖核酸酶的分离纯化和理化性质*

耿雪冉，柳万石，王贺祥**

（1．中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室，北京 100193；2．金亨稷师范大学，朝鲜 平壤 999093）

污白干酪菌核糖核酸酶的分离纯化和理化性质*

耿雪冉1，柳万石2，王贺祥1**

（1．中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室，北京 100193；2．金亨稷师范大学，朝鲜 平壤 999093）

采用DEAE-cellulose阴离子交换层析、CM-cellulose阳离子交换层析和FPLC-Superdex-75凝胶过滤层析，从污白干酪菌（Tyromyces amygdalinus）干子实体纯化得到一种核糖核酸酶，SDS-PAGE电泳检测其为单一蛋白，分子量为25 kDa。最适反应条件为60℃，pH4．4。该酶对几种寡聚核糖核苷酸的水解活性低于对t-RNA的水解活性。

污白干酪菌；核糖核酸酶；分离纯化；理化性质

核糖核酸酶（ribonuclease,RNase），是一类广泛存在于动物、植物以及微生物体内的核酸水解酶，其全名为聚核苷-α-寡核苷转移酶。核糖核酸酶的主要生理功能是降解生物体内的RNA，控制RNA的种类以及数量，参与核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解等过程；还与某些植物的自交不亲和性、器官发生、控制肿瘤血管生成[1]、杀灭肿瘤细胞以及抑制病毒（包括HIV-1）的复制等有关[2]。

迄今为止，已经从多种大型真菌中分离纯化得到的核糖核酸酶有20多种，比如香菇（Lentinus edodes）[3]、刺芹侧耳 （Pleurotus eryngii）[4]、凤尾菇（Pleurotus sajor-caju）[5]等。这些大型真菌来源的核糖核酸酶的分子量、理化性质以及氨基酸序列都存在较大差异，生物学功能也各不相同。

污白干酪菌（Tyromyces amygdalinus）隶属于担子菌门（Basidiomycota） 层菌纲（Hymenomycetes）非褶菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）干酪菌属（Tyromyces）。污白干酪菌分布于河北、安徽、浙江、湖南、海南、四川、贵州、云南、福建等地，夏秋季生树木上，可导致木材腐朽。目前对该菌的研究较少，尤其是生理活性物质的研究更少。本文从污白干酪菌的子实体中分离纯化出一种核糖核酸酶，并对其部分性质进行研究，拟为污白干酪菌核糖核酸酶进一步的研究应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

污白干酪菌干子实体。

1.2 试验方法

1．2．1 核糖核酸酶活性测定方法

将5 μL酶液加到135 μL，0．1 mol·L-1pH4．4 NaAc-HAc缓冲液中，然后加入10 μL底物tRNA（10 mg·mL-1）；空白对照以5 μL去离子水代替酶样品，其他同样品管。将其充分混匀后，37℃水浴反应15 min，迅速加入350 μL 3．8%高氯酸终止反应，12 000 r·min-1离心5 min后取上清于260 nm处测定吸光度。

酶活性定义：以260 nm处每分钟、每毫升反应液产生1个吸光值所需要的酶量作为一个酶活力单位。

1．2．2 核糖核酸酶粗样品的制备

称量污白干酪菌干子实体10 g，加入200 mL的去离子水组织匀浆破碎，4℃抽提过夜。匀浆液9 000 r·min-1离心10 min，取上清液，得到粗样品。

1．2．3 DEAE-cellulose阴离子交换层析

粗提取物通过DEAE-cellulose阴离子交换层析，层析柱预先用10 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8．4） 缓冲液平衡，上样后以同一缓冲液将不吸附的组分洗脱，再分别用含150 mmol·L-1NaCl、500 mmol·L-1NaCl和1 mol·L-1NaCl的缓冲液进行分段洗脱，得到活性组分。

1．2．4 CM-cellulose阳离子交换层析

将DEAE-cellulose阴离子交换层析所得活性组分充分透析后，通过预先用10 mmol·L-1pH 4．4 NaAc-HAc-缓冲液平衡好的CM-cellulose阳离子交换层析柱，上样之后以同一缓冲液将不吸附的组分洗脱下来，再分别用含150 mmol·L-1NaCl、300 mmol·L-1NaCl和1 mol·L-1NaCl的缓冲液进行分段洗脱，得到活性组分。

1．2．5 FPLC-Superdex-75HR 10/300凝胶过滤层析

将CM-cellulose阳离子交换层析所得活性组分充分透析，冷冻干燥，进行FPLC-Superdex-75凝胶过滤层析，层析柱预先用150 mmol NH4HCO3（pH 8．4）缓冲液平衡，即得到活性组分。

1．2．6 SDS-PAGE电泳检测

纯化所得的核糖核酸酶通过SDS-PAGE检验纯度及分子量。取20 μL核糖核酸酶样品，加入5 μL上样缓冲液，混合后煮沸5 min，12 000 r·min-1离心1 min，取上清，加样，电泳检测。电泳条件：浓缩胶（5%）和分离胶（15%）采用恒压180 V。电泳完毕后，加入考马斯亮蓝G-250染色1 h～2 h，脱色液脱色至本底无色，对比标准蛋白分子量并且结合FPLC结果计算分离得到的核糖核酸酶分子量。

1．2．7 RNase氨基酸序列的质谱分析

RNase氨基酸序列的质谱分析由广州辉骏生物科技公司完成，所用仪器为纳升级高效液相色谱仪－线性离子肼－静电场轨道肼质谱联用仪（nano-flow HPLC-LTQ-Orbitrap mass spectrometer）。

1．2．8 RNase的理化性质

最适反应pH：配制0．1 mol·L-1不同pH的缓冲液，将纯化所得的RNase加入到上述缓冲液中，按照标准方法测定酶活力，活力最高值为100%，以相对活力为纵坐标，相应的pH值为横坐标作图。

最适反应温度：将纯化所得的RNase在最适pH条件下，分别在4℃、15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的温度下反应15 min，按照标准方法测定酶活力，活力最高值为100%，以相对活力为纵坐标，相应的温度值为横坐标作图。

热稳定性：将纯化所得的RNase在不同温度条件下作用1 h后，按照标准方法测定酶活力，未孵育的初始活力值为100%，以相对活力为纵坐标，相应的温度值为横坐标作图。

RNase对寡聚核糖核苷酸的水解作用：以10 mg·mL-1的poly（A）和poly（C）为反应底物，将5 μL的酶样品加入到 135 μL，0．1 mol·L-1pH4．4 NaAc-HAc缓冲液中，然后加入10 μL底物；空白对照以5 μL去离子水代替酶样品，其余都相同。充分混匀后，置于37℃水浴反应15 min，迅速加入350 μL 3．8%高氯酸终止反应，12 000 r·min-1离心5 min，poly（A）上清在260 nm处测定吸光值，poly（C）上清在280 nm处测定吸光值。

2 结果与分析

2.1 污白干酪菌RNase的分离纯化结果

污白干酪菌RNase洗脱曲线见图1。

图1 RNase在DEAE-cellulose和CM-cellulose的洗脱曲线Fig.1 Elution profiles of RNase on DEAE-cellulose column and CM-celllulose column

污白干酪菌子实体经过组织匀浆、抽提后得到的粗样品通过DEAE-cellulose阴离子交换层析分段洗脱，其洗脱曲线如图1a所示，得到了4个组分的洗脱峰D1、D2、D3和D4。经过测定各洗脱峰的RNase酶活性，发现酶活性主要集中在D3组分。收集D3组分，充分透析，通过CM-cellulose阳离子交换层析，得到了4个峰，洗脱曲线如图1b所示。通过检测RNase活性，发现RNase活性集中在C2组分。污白干酪菌RNase在Superdex 75的洗脱曲线及SDS-PAGE电泳图见图2。

图2 RNase在Superdex-75洗脱曲线及SDS-PAGE电泳图Fig.2 FPLC-gel filtration of RNase on Superdex-75 HR 10/300column and SDS-PAGE of fraction SU1

收集C2组分，透析冻干后，进行FPLC-Su perdex-75 HR10/300凝胶过滤层析，其洗脱曲线见图2a，得到2个洗脱峰SU1和SU2，活性主要集中在SU1。SU1峰呈现的是一个单一且对称的峰，所以初步判断得到的核糖核酸酶是单一组分。收集SU1活性峰的组分，冻干后电泳检查纯度。污白干酪菌RNase的分子量是25 kDa。

2.2SDS-PAGE电泳检测结果

SU1组分电泳结果为一条带（图2b），结合在Superdex-75 HR10/300凝胶过滤的结果，该酶的分子量为25 kDa。

2.3 污白干酪菌RNase的质谱结果分析

通过质谱分析，得到的短肽序列用Mascot匹配NCBInr数据库，污白干酪菌RNase蛋白条带匹配上8个肽段，分别为：LAAELALR、EVTEISEMDIK、LEINNDKK、SFSQMALLLATWKPMR、QEEVSIPK、NFRNNIDNQLNQGMR、MTYEIGDRLK、NNKDFVCVLMSEIFPSR。

2.4 污白干酪菌RNase的理化性质

污白干酪菌RNase的最适pH、温度，以及在不同pH缓冲液和不同温度中测定的酶活性见图3。

从图3可以看出，该酶的最适pH及温度分别为pH 4.4和60℃（图3a）。pH大于6.0，酶的活性非常低，仅为最高活性的20%及以下，然而在pH 3.0到pH 5.0范围内活性比较高，由此可见该酶是一种酸性核糖核酸酶（acid RNase，ACR）。从温度对污白干酪菌RNase活性的影响来看（图3b），与其他大部分已纯化出的核糖核酸酶差不多，在温度50℃～60℃范围内活性非常高，最适温度为60℃。温度高于70℃酶迅速失活。污白干酪菌RNase在不同温度条件下处理1 h后，酶活性如图3c所示。温度低于60℃，酶的活性比较稳定，在60℃处理1 h后仍保持有80%的酶活性时，但温度高于60℃时，酶迅速失活。

图3 污白干酪菌RNase的理化性质Fig.3 Characteristics of Tyromyces amygdalinus RNase

RNase对寡聚核糖核苷酸的水解活性远远低于对t-RNA的水解活性，该RNase对poly（A）、poly（C）均有一定的水解能力，其活性分别为（4.46± 0.4） U·mg-1和（5.33±0.3） U·mg-1，然而对t-RNA的活性为（40.0±1.9）U·mg-1。

3 结论

通过各种层析从污白干酪菌中分离纯化得到一种核糖核酸酶，其分子量为25 kDa。该酶最适作用温度和pH分别为60℃和pH 4.4。该酶对poly（A）和poly（C）均有一定的水解作用。

[1]聂明建,王国槐.植物核糖核酸酶与转基因工程雄性不育系研究进展[J].中国农学通报，2006（3）：122-127.

[2]Dewi DL,Ishii H,Haraguchi N,et al.Dicer 1,ribonuclease type III modulates a reprogramming effect in colorectal cancer cells[J].Int J Mol Med,2012,29(6):1060-1064.

[3]Kobayashi H,Itagaki T,Inokuchi N,et al.A new type of RNase T2 ribonuclease in two Basidiomycetes fungi,Lentinus edodes and Irpex lacteus[J].Biosci Biotechnol Biochem,2003, 67(10):2307-2310.

[4]Ng TB,Wang HX.A novel ribonuclease from fruiting bodies of the common edible mushroom Pleurotus eryngii[J].Peptides,2004,25(8):1365-1368.

[5]Ngai PH,Ng TB.A ribonuclease with antimicrobial,antimitogenic and antiproliferative activities from the edible mushroom Pleurotus sajor-caju[J].Peptides,2004,25(1):11-17.

全球食用菌市场将迎来新发展阶段

据美国最新报道称，由于全球消费者对有机产品的需求不断增加，2018年全球食用菌市场将迎来新的发展阶段。全世界的农民已经开始着手发展蘑菇种植，并把它作为更有利可图的产业之一。

当下，一些因素扩大了蘑菇市场高收益系统的发展，增加了需求饱和，提高了客户对产品的增值接受度和改变了超市丰富的产品种类。然而，也有一些制约全球蘑菇市场增长的因素，比如蘑菇食品的短期保质期，添加使用不安全的成分或是防腐剂等。

蘑菇是有营养的，应对全世界人民进行普及。同时，增加蘑菇更深层次的研究、开发更多趣味活动，打造更全面的蘑菇创新理念，将进一步加速全球蘑菇的市场发展。

中国食用菌商务网 2015.10.30

Purification and Characterization of Ribonuclease from Tyromyces amygdalinus

GENG Xue-ran1,Ryu Mansok2,WANG He-xiang1
（1．State Key Laboratory for Agrobiotechnology and Department of Microbiology,College of Biologial Sciences,China Agricultural University,Beijing 100193,China; 2．Pyongyang KimHyongJik University of Education,Pyongyang 999093,D．P．R．Korea）

A novel ribonuclease (RNase)was purified from dry fruit bodies of Tyromyces amygdalinus using a purification procedure which involved ion exchange chromatography on DEAE-cellulose,CM-cellulose and gel filteration chromatography by FPLC on superdex 75HR 10/300 column．Combine with the result from FPLC and SDS-PAGE,it was estimated that this ribonuclease was a monomeric protein with a molecular weight of 25 kD．The optimum temperature of this RNase is 60℃,and optimum pH of it is 4．4．The activity of this enzyme toward poly A and poly C was lower than that of t-RNA．

Tyromyces amygdalinus;ribonuclease;purification;characterization

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0063-04

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．016

现代农业产业技术体系建设专项基金（CARS-24）。

耿雪冉（1988-），女，在读博士研究生，主要研究方向为药用与食用真菌。E-mail:gengxueran2007@163．com

**通信作者：王贺祥（1957-），男，博士，教授，主要从事药用与食用真菌研究。E-mail:hxwang@cau．edu．cn

2015-09-09