产磷脂酶菌株蜡样芽胞杆菌AF-1发酵条件的研究

占剑峰，胡孝明，王蔚新，吴 鹏

（1.黄冈师范学院经济林木种质改良重点实验室，湖北 黄冈 438000；2.大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北 黄冈 438000）

磷脂酶是一类可以将非水化磷脂水解成为脂肪酸和水化磷脂的酶类，在植物油脱胶以及乳制品加工业、焙烤食品工业、蛋黄酱加工业等领域具有重要用途。酶法脱胶是一种经济节约、高效稳定、绿色环保的毛油脱胶方法[1-2]。目前，毛油脱胶所用的磷脂酶主要通过微生物发酵得到，国内外学者已经进行了相关研究。KIM M[3]等以木糖、磷酸氢铵和硫酸铵为最佳复合碳氮源，发酵得到磷脂酶酶活力为18 U/mL；SIMKHADA J R等[4]以葡萄糖2%、酵母膏1.5%、蛋白胨0.5%为碳氮源得到磷脂酶活力为4.5 U/mL；付建红等[5]在接种量为2%，装液量为50 mL/250 mL，25 ℃条件下培养36 h，磷脂酶活力达到17.5 U/mL；王金梅等[6]以葡萄糖1.0%、牛肉膏0.75%、蛋白胨0.75%分别为碳氮源，发酵72 h得到磷脂酶活力为44 U/mL；司武阳等[7]以氯化铵、麦芽糖和卵磷脂为复合碳氮源得到磷脂酶活力为18.68 U/mL。

微生物发酵是一个受多种因素影响的过程，发酵产物决定于微生物的性能和培养环境，如培养基的组成配比、微生物的种龄和发酵条件等[8-10]。因此，如何充分发挥微生物的生长能力，实现目标酶的高产，需要从培养基成分和发酵条件进行优化[11-13]。

本研究以磷脂酶活力和生物量为参考指标，首先在摇瓶水平对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）AF-1的培养基成分及发酵培养条件进行优化，进一步采用15 L发酵罐考察发酵温度、时间和通气量对产磷脂酶的影响，为磷脂酶的扩大培养和工业化生产奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）AF-1：实验室筛选，固体斜面4 ℃保存。

1.1.2 培养基

种子培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，

pH 7.2～7.4。

发酵培养基：葡萄糖15 g/L，蛋白胨15 g/L，磷酸氢二钠15 g/L，磷酸二氢钾3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，氯化钙0.1 g/L，pH 7.2。

1.1.3 化学试剂

琼脂：天津市福晨化学试剂厂；麦芽糖、蔗糖（分析纯）、淀粉（分析纯）、磷酸氢二铵（分析纯）：上海沪试化工有限公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；大豆磷脂粉末：北京鸿润宝顺科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9003电热恒温培养箱：中新医疗仪器有限公司；752紫外光分光光度计：南京麒麟分析仪器有限公司；SHY-2A水浴恒温振荡器：江苏金坛市金城国盛实验仪器厂；Biotch-8000全自动控制发酵罐：上海保兴生物设备工程有限公司；T50自动滴定仪：梅特勒-托利多仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

种子活化：三角瓶中装入种子培养基，从斜面上取2环接入培养。

摇瓶发酵培养方法：三角瓶中装发酵培养基，将种子液接入培养。

15 L发酵罐发酵培养：装液系数（装液体积/发酵罐体积）为0.67，将培养好的种子培养液以10%体积分数的接种量接入发酵罐。

1.3.2 培养基组成的确定

发酵培养基组成中，依次改变培养基中碳源、氮源的种类，确定碳源和氮源的浓度和比例，无机盐的浓度和比例，将发酵液离心取上清液，测定不同组成对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）AF-1发酵产磷脂酶活力的影响。

1.3.3 培养条件的确定

分别改变发酵培养基的接种量（1%、5%、10%、15%、20%）、装液量（25 mL/250 mL、50 mL/250 mL、75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、150 mL/250 mL）、pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、发酵温度（20℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）和发酵时间（18 h、24 h、30 h、36 h、42 h），发酵后测定其生物量和酶活力以确定最佳培养条件。

1.3.4 发酵罐（15 L）扩大培养条件优化

扩大培养过程，分别调节发酵培养的温度（30 ℃、35 ℃、40 ℃）、发酵培养基的初始pH值（7.0、7.5）和通气量（0.2 m3/h、0.3 m3/h、0.4 m3/h），测定其生物量和酶活力以确定最佳扩大培养条件。

1.3.5 磷脂酶活力及生物量的测定方法

[14]方法，测定磷脂酶活力。酶活力单位定义为：在特定条件下1 min水解磷脂产生1 μmol 量游离脂肪酸所需的酶量即为一个磷脂酶活力单位（U/mL）。

采用比浊法[15]测定生物量。

2 结果与分析

2.1 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）AF-1的生长曲线

250 mL三角瓶中装30 mL种子培养液，从斜面上取2环菌体接入，37 ℃、180 r/min培养24 h，每隔2 h取一次样，波长600 nm条件下测定Bacillus cereusAF-1的生长曲线，结果见图1。

图1 Bacillus cereus AF-1生长曲线Fig.1 Growth curve of Bacillus cereus AF-1

由图1可知，种子液的生长情况为：0～2 h为延迟期、2～14 h为对数生长期，14 h后进入稳定期，20 h后进入衰老期。幼龄和老龄菌种适应性差，延滞期长，不利于菌种的生长和产物的合成，因此选择在对数期生长的12 h的种子液进行发酵培养。

2.2 发酵培养基的优化

2.2.1 碳源

培养基中分别加入15 g/L葡萄糖、蔗糖、淀粉、麦芽糖4种碳源。装液量为50 mL/250 mL，将培养好的种子液以10%的接种量接入，摇床温度为37 ℃，转速180 r/min，测定发酵液酶活力，结果见图2。

图2 不同碳源对磷脂酶活力的影响Fig.2 Effect of different carbon source on enzyme activities

碳源是构成细胞物质或为机体提供所需要的能量，是影响菌体生长和代谢产物合成的关键因素。由图2可知，当葡萄糖、蔗糖、淀粉、麦芽糖作为不同碳源时，在一定的发酵时间内，以葡萄糖为碳源的发酵液酶活力明显高于其他碳源。综合考虑磷脂酶活力和发酵时间，选择葡萄糖作为最佳碳源。

2.2.2 氮源

培养基中分别加入15 g/L蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、（NH4）2HPO4、NH4Cl 5种氮源。装液量为50 mL/250 mL，将培养好的种子液以10%的接种量接入，摇床温度为37 ℃，转速180 r/min，测定发酵液酶活力，结果见图3。

图3 不同氮源对磷脂酶活力的影响Fig.3 Effect of different nitrogen source on enzyme activities

氮源构成微生物细胞和含氮的代谢产物，对于获得代谢产物具有重要影响。由图3可知，无机氮源得到的发酵液酶活力都远低于有机氮源，蛋白胨作为氮源时，发酵液的酶活力高于其他有机氮源，因此，选择蛋白胨作为氮源。

2.2.3 葡萄糖和蛋白胨的添加量

碳氮比对于发酵过程有着较大的影响。例如碳源过多，会形成较低的pH值；碳源不足，则易引起菌体衰老和自溶；氮源过多，易形成较高的pH值；氮源不足，菌体繁殖量少而影响产量。以葡萄糖和蛋白胨分别作为碳、氮源，添加量分别设置为1%、2%、3%、4%进行发酵，发酵条件同上，考察葡萄糖和蛋白胨添加量对磷脂酶活力的影响，结果见表1。

表1 葡萄糖和蛋白胨添加量对磷脂酶活力的影响Table 1 Effect of glucose and peptone concentration on enzyme activities U/mL

由表1可知，当葡萄糖和蛋白胨添加量低时，由于碳源和氮源不足，造成菌体衰老和自溶，菌体量减少导致酶活力低；添加量高时，菌体量增加，造成酶活力偏低。葡萄糖2%，蛋白胨3%时磷脂酶活力最大。因此，选择葡萄糖和蛋白胨添加量分别为2%和3%。

2.2.4 无机盐的种类及添加量

以磷脂酶活力为评价指标，选取因素磷酸氢二钠（A）、磷酸二氢钾（B）、硫酸镁（C）、氯化钙（D）4种无机盐进行L9（34）正交试验，结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2 无机盐添加量优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for inorganic salt addition optimization

由表2可知，对磷脂酶活力影响的无机盐由大到小的顺序为磷酸氢二钠（A）＞磷酸二氢钾（B）＞硫酸镁（C）＞氯化钙（D）。无机盐的最佳组成为A2B2C3D2，即磷酸氢二钠1.5%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.06%，氯化钙0.01%。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知，磷酸氢二钠添加量对磷脂酶活力影响显著，与极差分析结果一致。其他因素均无显著影响。

2.3 发酵条件的优化

2.3.1 接种量

由图4可知，当接种量过小时，发酵周期延长，不利于高产酶；而接种量＞10%时，微生物增长过快并产生过多的代谢废物，使菌种老化，也不利于酶的合成，故选择10%为最佳接种量。

图4 接种量对菌种生长和磷脂酶产量的影响Fig.4 Effect of inoculum on bacteria growth and phospholipase production

2.3.2 装液量

图5 装液量对菌种生长和磷脂酶产量的影响Fig.5 Effect of loading volume on bacteria growth and phospholipase production

由图5可知，生物量与装液量成反比，装液量较多时，会影响发酵液的溶氧，说明这种菌种是好氧菌；但产酶量在50 mL/250 mL时达到最大值，综合考虑，选择50 mL/250 mL为最佳装液量。

2.3.3 培养基初始pH 值

图6 起始pH值对菌种生长和磷脂酶产量的影响Fig.6 Effect of initial pH on bacteria growth and phospholipase production

由图6可知，当初始pH值为7.0时，生物量最大（OD600nm0.95）和发酵液的酶活力最高（22.98 U/mL），表明pH值7.0为该菌发酵合适的初始培养基pH值。微生物需要在一定的pH值环境中方能正常生长繁殖，如果pH值不适，不但会妨碍微生物菌体的正常生长，而且还会改变微生物的代谢途径和代谢产物的性质。

2.3.4 发酵温度

图7 发酵温度对菌种生长和磷脂酶产量的影响Fig.7 Effect of fermentation temperature on bacteria growth and phospholipase production

由图7可知，35 ℃时菌体生物量最大（OD600nm1.15）和发酵液酶活力最大（26.13 U/mL），说明该温度下适合菌体的生长和磷脂酶合成的积累。温度的变化对发酵过程中酶反应的速率、蛋白质的性质和发酵液的物理性质产生影响，进而影响发酵的动力学特性和产物的合成。

2.3.5 发酵时间

图8 发酵时间对菌种生长和磷脂酶产量的影响Fig.8 Effect of fermentation time on bacteria growth and phospholipase production

由图8可知，30 h后酶活力达到最大值25.82 U/mL，36 h后菌体生长量达到最大值OD600nm1.14，综合考虑，培养时间为30 h。发酵时间短，菌体生长不足导致生成的酶活力低，但是随着发酵时间延长，营养物质不断减少，组成成分也发生改变，菌体释放体内的分解酶及各种环境因子的改变抑制了酶的活性。

2.4 发酵罐（15 L）扩大培养条件优化

以优化后的培养基和培养条件，在15 L发酵罐中扩大培养，6 h取一次样，对发酵过程中温度、pH值和通气量的情况进行控制和分析，结果见图9～图11。

图9 不同发酵温度对生物量(A)及磷脂酶产量(B)的影响Fig.9 Effect of fermentation temperature on bacteria growth (A) and phospholipase production (B)

图10 起始p H值对生物量(A)及磷脂酶产量(B)的影响Fig.10 Effect of initial pH on bacteria growth (A) and phospholipase production (B)

图11 空气流量对生物量(A)及磷脂酶产量(B)的影响Fig.11 Effect of airflow rate on bacteria growth (A) and phospholipase production (B)

由图9可知，温度较低时不利于菌体的生长和磷脂酶的生成，而高温仅在开始18 h内有利于磷脂酶的合成和菌体的生长，因此，利用开始阶段促进生物量的积累，然后有利于磷脂酶的合成，所以磷脂酶合成的适宜发酵温度为35 ℃。

由图10可知，发酵液的pH值由7.0提高到7.5时，生物量和酶活力均提高，只是生物量在24 h达到最大值OD600nm1.15，而酶活力在30 h达到最大值39.88 U/mL，可见弱碱性条件适合Bacillus cereusAF-1的细胞生长。

由摇瓶扩大到15 L发酵罐后，最适pH值由7.0提高到7.5，可能由于前期发酵消耗了一定的碳源，产生的二氧化碳使得pH值下降，这种情况在加氧发酵时效果更加明显，所以当pH值为弱碱性时，正好抵消了这种影响。

由图11可知，在开始阶段通气量增加有利于菌体的生长和酶的生成，但是随着发酵的继续进行，通气量为0.3 m3/h的发酵液在24 h和30 h分别得到了最大生物量OD600nm1.18和酶活力41.57 U/mL，表明通气量过高导致菌体前期生长旺盛，导致了碳源不足和菌体的衰老，结合发酵罐中产生的气泡情况，通气量为0.3 m3/h有利于酶的合成与积累。

3 结论

以蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）AF-1发酵产磷脂酶，最佳培养基为葡萄糖2%，蛋白胨3%，磷酸氢二钠1.5%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.06%，氯化钙0.01%。在摇瓶中发酵产磷脂酶，最佳条件为发酵时间30 h，发酵温度35 ℃，初始pH值7.0，装液量50 mL/250 mL，接种量10%。

在15 L发酵罐中发酵产磷脂酶，最佳发酵条件为培养基pH值为7.5，装液系数为0.67，接种量10%，发酵温度35 ℃，通气量0.3 m3/h，得到的粗酶液酶活为41.57 U/mL。

参考文献：

[1]李秋生，杨继国，杨 博，等.不同磷脂酶用于植物油脱胶的研究[J].中国油脂，2004，29（1）：19-22.

[2]李树雨，韩 锋.酶法脱胶工厂化试验[J].大豆通报，2008（2）：40-41.

[3]KIM M,KIM J,RHEE J.Isolation of a phospholipase A1-producing microorganism[J].J Ind Microbiol Biot,1996,16(3):171-174.

[4]SIMKHADA J R,CHO S S,LEE H J,et al.Purification and biochemical properties of phospholipase d(PLD57)produced byStreptomycessp.CS-57[J].Arch Pharm Res,2007,30(10):1302-1308.

[5]付建红，唐辉桂，姚 斌，等.一株产低温碱性磷脂酶A1 耐冷细菌的筛选及发酵条件的初步研究[J].工业微生物，2008，38（5）：12-16.

[6]王金梅，姜芳燕，戴大章，等.磷脂酶高产菌株的筛选，诱变及其在豆油脱胶中的应用[J].环境科学研究，2010，23（7）：948-952.

[7]司武阳，薛正莲，赵梦梦，等.磷脂酶A1 产生菌株的筛选[J].食品与发酵科技，2010，46（2）：27-30.

[8]AUDET P,PAQUIN C,LACROIX C.Sugar utilization and acid production by free and entrapped cells ofStreptococcus salivariussubsp.thermophilus,Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus,andLactococcus lactissubsp.lactis in a whey permeate medium[J].Appl Environ Microbiol,1989,55(1):185-189.

[9]刘海军，乐超银，邵 伟，等.一株高产蛋白酶芽孢杆菌的鉴定[J].中国酿造，2009，28（9）：18-20.

[10]ROUKAS T,KOTZEKIDOU P.Continuous production of lactic acid from deproteinized whey by coimmobilizedLactobacillus caseiandLactococcus lactiscells in a packed-bed reactor[J].Food Biotechnol,1996,10(3):231-242.

[11]欧阳平凯，曹竹安，马宏建.发酵工程关键技术及其应用[M].北京：化学工业出版社，2005.

[12]董 丹，陈 燕，关统伟，等.豆瓣发酵瓣子中淀粉酶高产菌株的筛选及其酶活力的测定[J].中国酿造，2015，34（2）：68-71.

[13]袁春红，宋菲菲，林 凯，等.白酒发酵副产物黄水中两株产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定[J].中国酿造，2014，33（11）：90-93.

[14]占剑峰，姜绍通，潘丽军.磷脂酶酶活力测定条件的优化[J].食品科学，2012，33（17）：174-178.

[15]沈 萍，陈向东.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2007.