家族性阿尔茨海默病家系淀粉样前体蛋白基因突变检测

商丹丹，田 杰，季 燕，史长河，吴 军，杨 靖，秦 洁，宋 波，王莉梅，毛澄源，骆海洋，许予明，孙石磊#

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)郑州铁路职业技术学院护理学院 郑州 450052

家族性阿尔茨海默病家系淀粉样前体蛋白基因突变检测

商丹丹1)，田 杰2)，季 燕1)，史长河1)，吴 军1)，杨 靖1)，秦 洁1)，宋 波1)，王莉梅1)，毛澄源1)，骆海洋1)，许予明1)，孙石磊1)#

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)郑州铁路职业技术学院护理学院 郑州 450052

#通信作者，女，1969年9月生，博士，教授，研究方向：神经遗传变性病，E-mail：sunshilei18@hotmail.com

阿尔茨海默病；淀粉样前体蛋白基因；突变

目的：研究1个中国汉族早发型家族性阿尔茨海默病(EOFAD)家系的临床症状及其致病基因的突变形式。方法：收集1个EOFAD家系，分析2例患者及其他家系成员的临床表现及辅助检查结果。采集患者及部分家系成员外周血，提取基因组DNA，应用PCR联合直接测序法依次行早老素1(PS-1)基因、早老素2(PS-2)基因及淀粉样前体蛋白(APP)基因第16、17号外显子基因检测。结果：该家系2例患者发病年龄较早，均以记忆力下降为首发症状，病情呈进行性加重，均出现癫痫大发作及肌张力增高等其他痴呆类型少见的临床症状。在该家系2例患者中发现APP基因第17号外显子2 149位碱基发生G→A突变，使APP第717号氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸，发生V717I突变；未发现PS-1、PS-2基因突变。结论：在中国汉族EOFAD家系中发现了APP基因的V717I突变，进一步证明了APP基因突变是EOFAD的重要致病原因。

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种进行性神经系统退行性疾病，主要表现为认知功能、日常生活能力下降及精神行为异常等。以65岁为界，AD可分为早发型AD(early-onset AD,EOAD)及晚发型AD(late-onset AD,LOAD)。62%的EOAD患者有家族史，其中约13%符合常染色体显性遗传[1]。EOAD主要与早老素(presenilin,PS)-1、PS-2、淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)、Tau蛋白等基因突变有关。Raux等[2]于2005年报道，在常染色体显性EOAD中约66%由PS-1基因突变引起，16%由APP基因突变引起。作者收集了1个早发型家族性AD(early-onset familial AD,EOFAD)家系，观察其临床表现，并对其进行PS-1基因、PS-2基因及APP基因第16、17号外显子检测，以期进一步了解国内EOAD家系基因突变情况及丰富AD基因突变数据库。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2013年就诊于郑州大学第一附属医院神经内科的1个家族性认知功能下降家系，应用简易精神状态量表(mini-mental state examination,MMSE)、蒙特利尔认知评估量表(montreal congnitive assessment,MoCA)及日常生活能力量表(activity of daily living scale,ADL)行痴呆筛查。采用美国神经病学、语言机能障碍和卒中研究所及AD和相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)修订后标准[3]进行AD的诊断。该研究获郑州大学第一附属医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 临床资料收集 对家系成员进行详细的神经系统检查及体格检查，完善甲状腺功能、叶酸、维生素B12、肝肾功能及头部MRI检查，并详细询问病史及家族史。

1.3 基因测序及产物分析 抽取患者及部分家系成员外周血2 mL，提取外周血基因组DNA，将DNA样本稀释至50 mg/L备用。引物设计参照文献[4]，由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。PCR反应体系为25 μL：DNA模板2 μL，正、反向引物(20 μmol/L)各0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix(上海生工生物工程股份有限公司)12.5 μL，超纯水9.5 μL。扩增条件：95 ℃预变性10 min； 95 ℃变性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，以后每个循环退火温度降低1 ℃直到48 ℃，共19个循环； 95 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共20个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μL反应产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，之后进行goldview染色并在紫外线下观察结果。将上述PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司直接测序。测序结果应用DNASTAR(Vension 7.1)软件分析，并与人类基因组基因比对。

2 结果

2.1 临床资料及辅助检查结果 EOFAD家系图见图1。先证者(图1 Ⅲ-3)，女，48岁，河南人。患者4 a前逐渐出现记忆力下降，以近期记忆下降为主，远期记忆尚可，头部MRI示脑萎缩；3 a前上述症状明显加重，伴精神行为异常、性格改变，表现为不认路、不认人、自言自语、喜欢骂人、易激惹、出现幻觉，渐出现小便失禁、不避人，上述症状进行性加重；目前全面认知功能下降，日常生活完全不能自理。期间于多家医院就诊，诊断不明，间断服用“天智颗粒、银杏叶片”等治疗，效果差。后期随访发现其于49岁时出现癫痫大发作。查体：神志清、易激惹，记忆力、计算力、定向力、理解力、阅读能力均下降。颅神经查体无异常。四肢肌力正常，肌张力增高，四肢腱反射亢进，双侧病理征阴性，共济、深浅感觉查体不配合。家族史：其外祖父(图1 Ⅰ-2)已逝，生前有“痴呆”病史，具体病情及死因不详；其母(图1 Ⅱ-2)，50岁左右出现认知功能下降，生前有走失史，未予诊治，死因不详。其姐(图1 Ⅲ-2)，50岁，7 a前出现记忆力下降，渐出现不认人、不认路、日常生活能力下降，1 a前出现全面认知功能下降，大小便失禁，但尚可自行进食，于50岁时出现癫痫大发作1次。查体结果同Ⅲ-3。家系中余成员无类似表现。辅助检查：Ⅲ-2、Ⅲ-3甲状腺、肝、肾功能和血脂、叶酸、维生素B12、血同型半胱氨酸水平均正常。部分家系成员主要临床特征及辅助检查结果见表1。Ⅲ-2、Ⅲ-3诊断为AD，均于45岁之前发病，且家系中Ⅰ-2、Ⅱ-2有类似病史，Ⅱ-2于50余岁发病，该家系符合EOFAD。

图1 EOFAD家系图

指标Ⅲ-1Ⅲ-2Ⅲ-3性别男女女发病年龄/岁-4344起病形式-缓慢缓慢病程-约7a约4a首发症状无记忆力下降记忆力下降精神障碍无有有癫痫无有有头部MRI正常脑萎缩脑萎缩MMSE评分3032MoCA评分2900

-：未发病。

2.2 DNA测序结果 采集该家系中Ⅱ-1、Ⅲ-1、Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅲ-6外周血并行基因检测(未采集到Ⅲ-4、Ⅲ-5外周血)，在家系Ⅲ-2、Ⅲ-3中发现APP基因第717号密码子发生GTC→ATC错意突变(第17号外显子第2 149位碱基发生G→A突变)，使氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸(V717I)，而在Ⅱ-1、Ⅲ-1、Ⅲ-6中均未发现APP、PS-1、PS-2基因突变(图2)。

图2 APP基因第17号外显子测序结果

a：正常测序图，其第2 149位碱基为G(箭头所示)；b、c：Ⅲ-2、Ⅲ-3的第2 149位碱基发生G→A突变(箭头所示)。

3 讨论

我国对EOAD的遗传学研究已取得一定的进展，目前已有PS-1、APP基因突变被报道，如PS-1 V97L、A136G、S169del、APP V715M等[5-7]。由APP基因突变引起的家族性AD在中国EOFAD患者中并不常见[8-9]。

β淀粉样蛋白(Aβ)在脑内异常聚集是AD的标志性病理改变，是由跨膜蛋白APP裂解而成，其通过影响神经递质的释放、炎症反应、氧化应激及致细胞内钙稳态失衡等多种途径发挥神经毒性作用。APP有两种裂解途径：正常情况下APP在α-分泌酶的作用下产生非致病性片段，只有当编码APP的基因发生突变或其他原因导致β-分泌酶活性异常增高时产生Aβ42和Aβ40，而Aβ42的绝对或者相对增高是AD的重要病理过程[10]。APP基因位于21号染色体上。既往研究[11-12]对APP全部编码区行直接测序分析，但检测结果表明基因突变均发生在APP的第16、17号外显子上，因此该研究中作者只对APP基因第16、17号外显子行基因突变分析。该研究发现的APP基因V717I 突变也称为London APP，是世界上报道的第一种引起EOFAD的致病基因突变形式[13]。

回顾分析既往研究可以发现，不同APP基因突变类型的临床特征不尽相同，存在异质性。APP第692～694位氨基酸改变主要与脑出血有关[14]，而既往报道[15-16]的London APP突变类型的主要临床特征为首发记忆力下降，其后出现失用、失语、精神行为异常，最后出现非齿轮样肌张力增高、额叶释放征，部分患者出现幻觉、癫痫、肌阵挛，直至坐椅不起。作者收集的这一EOFAD家系中，Ⅲ-3于44岁发病，首发症状为记忆力下降，其后逐渐出现失用、失语、日常生活能力丧失，病情进展较快，4 a内发展至大小便失禁、日常生活完全不能自理且于起病5 a后出现癫痫大发作；Ⅲ-2于43岁起病，病程变化同Ⅲ-3，但病情进展较Ⅲ-3慢，发病6 a后出现大小便失禁、日常生活完全不能自理，50岁出现癫痫大发作。该研究中AD患者起病及病情发展与既往报道的大多数APP V717I突变类型的AD患者相似，后期均出现癫痫大发作、肌张力增高症状，提示在EOFAD患者中应警惕此症状。

综上所述，作者在一中国EOFAD家系中发现APP基因第17号外显子2 149位碱基发生G→A突变，引起V717I突变。尽管APP基因突变在中国人群中并不普遍，但该研究结果丰富了AD基因突变数据库，提示在进行EOFAD基因筛查及产前诊断时勿遗漏APP基因检测。

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(2014-11-13 收稿 责任编辑徐春燕)

Mutational analysis of amyloid precursor protein gene in a family with Alzheimer disease

SHANGDandan1),TIANJie2),JIYan1),SHIChanghe1)，WUJun1),YANGJing1),QINJie1),SONGBo1),WANGLimei1),MAOChengyuan1),LUOHaiyang1),XUYuming1),SUNShilei1)

1)DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)SchoolofNursing,ZhengzhouRailwayVocationalandTechnicalCollege,Zhengzhou450052

Alzheimer disease; amyloid precursor protein gene; mutation

Aim: To analyze the clinical symptoms and mutation of pathogenic genes in a Chinese family with early-onset familial Alzheimer disease(EOFAD).Methods: The clinical features and the results of auxiliary examination were analyzed. By PCR and direct DNA sequencing, mutational analysis of presenilin-1(PS-1),presenilin-2(PS-2), and amyloid precursor protein(APP) gene was performed.Results: The two patients with early onset age developed an insidious onset of difficulties in memory. They both showed epilepsy, hypermyotonia and some other symptoms which were rarely found in the course of the disease. Molecular genetic analysis revealed that the 2 patients had a mutation of c.2 149 G→A in exon 17 of APP gene, which resulted in the amino acid substitution as V717I.Conclusion: There is a V717I mutation of the APP gene in a family with EOFAD,which demonstrates that APP gene mutation is the important pathogenesis of EOFAD.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.029

R749.16