鸭疫里默氏杆菌混合感染禽致病性大肠杆菌的分子检测与敏感药物快速筛选的研究

高梦月 秦香香 苏玲玲 成大荣

(扬州大学兽医学院 江苏 扬州225009)

鸭疫里默氏杆菌是危害鸭、鹅、火鸡的一种重要病原，当有其他微生物混合或继发感染时能造成更严重的经济损失，其中禽致病性大肠杆菌是RA最常见的混合或继发感染菌。二者在临床症状、病理变化及流行病学等方面均有诸多相似之处。因此常规的诊断方法很难快速、准确地作出诊断，故建立二者鉴别诊断的分子生物学方法十分必要。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与材料

Taq 酶、dNTPs、10×Buffer、DNA Marker DL1000、DNA MarkerDL2000、6×LoadingBuffer、大肠杆菌F菌毛、P菌毛、HPI的上下引物、鸭疫里默氏杆菌的上下引物，均由生工生物工程（上海）股份有限公司生产；参考菌株（来自家禽研究所）；革兰氏阴性菌药敏试剂盒（杭州天和微生物试剂有限公司）；冷冻离心机；PCR仪(美国PE公司)；电泳仪；凝胶成像仪。

1.2 实验方法

1.2.1 病料的采集与处理

2013年9 月至2014年5月，从扬州大学动物医院采集病料，采集其病变组织。在超净工作台中，用接种环蘸取病料分别接种于TSB琼脂平板和麦康凯琼脂平板。TSB琼脂平板置于含5%～10%CO2的蜡烛罐中37℃培养24h[1]；麦康凯琼脂平板置于37℃温箱中培养12h。挑取可疑菌落接种于肉汤培养基，增菌培养12h后，增菌液可用于制备模板。

1.2.2 参考菌株的肉汤培养

1.2.3 模板的制备

先在1.5mL的离心管中加入50μLddw，然后挑取长出的典型单菌落于离心管中，沸水浴10min后，置于-20℃冰箱中冻存5-10min，取出12000r离心10min,收集上清液作为模板备用。

1.2.4 引物的设计

表1 大肠杆菌F 菌毛、P 菌毛和HPI 的引物序列

表2 鸭疫里默氏杆菌的引物序列

1.2.5 PCR方法的建立

1.2.5.1多重PCR条件的优化

采用25μL反应体系，其中10×buffer2.5μL，dNTPs 2μL，Taq酶0.25μL，RA和APEC上、下引物各0.25μL，RA和APEC模板各1μL，补加17.25μLddw至25μL。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，72℃延伸55s，30个循环后，72℃延伸10min,通过改变退火温度而其他参数保持不变来优化PCR反应的条件，退火温度从50℃按梯度变化到60℃。

1.2.5.2多重PCR的特异性

鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌的参考菌株被用来确认多重PCR的特异性。从参考菌株提取的DNA作为多重PCR的模板，在优化条件下，进行PCR反应。

1.2.5.3多重PCR对临床病例的检测对采集的临床病料，用PCR方法进行检测，以验证所建立的多重PCR方法能否直接对病料进行检测。

1.2.6 PCR产物的电泳和鉴定

将经PCR扩增后的模板取出，分别加入10μL6×Loading Buffer，以DNA Marker DL1000作为标准DNA分子量，取10μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，染色后于凝胶成像仪中观察扩增片段大小。

1.2.7 药敏试验吸取检测为阳性的20株RA和20株APEC的快速增菌培养物，均匀涂布于培养平板，贴上药敏纸片，置于37℃恒温培养箱中培养24h。

2 实验结果

2.1 PCR方法的建立（图1）

图1 PCR 电泳结果

2.2 特异性检测

分别以已知血清型的鸭疫里默氏杆菌和禽致病性大肠杆菌作为参考菌株，并以鸭源巴氏杆菌菌株、鸭源沙门氏菌分离株为对照，结果鸭疫里默氏杆菌菌株出现大小为592bp的产物条带，禽致病性大肠杆菌菌株出现大小为420bp、700bp、287bp的产物条带，而对照株未出现相应条带。（图2）

2.3 药敏试验结果

药敏试验结果显示所有被检鸭疫里默氏杆菌菌株对卡那霉素、哌拉西啉、妥布霉素、氨苄西林的耐药率均达到了100%；对头孢他啶的敏感率达到了100%。禽致病性大肠杆菌对卡那霉素、哌拉西林、头孢唑啉、妥布霉素、头孢噻吩、氨苄西林、氧氟沙星和链霉素的耐药率均为100%；对头孢他啶的敏感率为100%。可见，禽致病性大肠杆菌的耐药性比鸭疫里默氏杆菌更强。

3 讨论

3.1 常规的PCR检测方法[2,3]只能进行单一细菌的检测。为了同时检测出两种菌且避免出现假阳性[4]，本研究在两者的高度保守区设计了四对特异性引物，通过菌落和菌液PCR均能获得特异性结果，增强了实际应用性。

3.2 来源不同的鸭疫里默氏杆菌和禽致病性大肠杆菌对药物敏感性各不一致[5]。因此,在治疗两种菌混合感染时要进行敏感药物筛选,以免造成药物和生产上的损失。

图2 特异性检测结果

[1]季权安，刘燕，等.鸭疫里默氏杆菌PCR快速检测方法的建立[J].浙江农业学报，2012,24(3):388-391.

[2]张蓉蓉,罗青平,等.4株鸭疫里默氏杆菌的PCR快速鉴定及药敏试验[J].湖北农业科学,2012,51(22):5193-5196.

[3]胡清海,刘晓文,等.应用PCR技术检测鸭疫里默氏杆菌的研究[J].中国预防兽医学报,2002,24(6):471-473.

[4]Gussow D,Glackson T.Direct clone characterization fromp-laques and colonies by the polymerase chain reaction[J].NucleicAcidsRes,1989,17:4.

[5]黄瑜,李文杨.番鸭大肠杆菌病的诊治[J].中国兽医杂志,2000,26(12):34-35.