高粱MATE基因的克隆及在酵母中的重金属耐受性分析

张苹，张源，王慧春，王文颖﹡，徐进﹡

（1.青海师范大学生命与地理科学学院，青海 西宁810008；2.中国科学院西双版纳热带植物园，云南 昆明650223；3.荒漠与绿洲生态国家重点实验室，中国科学院新疆生态与地理研究所，新疆 乌鲁木齐830011）

MATE转运蛋白 （multidrug and toxic compound extrusion transporter）是一类多药耐药性家族转运蛋白，它们的活性依赖于跨膜电化学势提供的能量［1］。在拟南芥中至少有56个基因属于MATE基因，在水稻基因组中也至少发现了50个MATE基因［2］。MATE家族在植物中的序列多样性以及表达模式的差异，决定了它们的功能差异性。最初发现，MATE家族的基因在细胞解毒机制中起重要作用。近年来发现，该家族基因在植物响应重金属毒害过程中也可能发挥重要作用［3］。

当今世界，重金属污染对农业和人类生活带来的影响日趋严重。一些重金属元素如Cu、Fe、Mn、Mo、Ni和Zn是植物的必需元素，缺乏这些元素会导致作物减产［4，5］，然而，浓度过高时则对植物造成伤害。Zn主要来源于采矿、电镀和冶炼行业污染物的排放。土壤中Zn超过200mg·kg－1时则可能对植物生长造成危害，过量Zn可以直接导致植物发生Zn中毒［6］。研究植物对Zn吸收、运输和累积的生理与分子机理，鉴定植物中的Zn转运蛋白，对于我们利用生物技术手段培育Zn高效利用作用，以及植物修复技术均有重要的意义。高粱是一种重要的能源经济作物，具有较高的重金属耐受性。为分离鉴定高粱中Zn响应的基因，我们通过深度测序技术，分析了高粱根系中差异表达的基因，发现了一个显著受Zn缺乏诱导的MATE家族基因SbMATE。我们利用酵母功能互补试验对该基因的功能进行了初步分析，为进一步探明该基因在植物Zn吸收和Zn毒害耐受中的功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

植物材料高粱品种BTx623由中科院景海春研究员馈赠。酵母菌株YK44（ura3－52his3－200，ΔZRC，ΔCot1，mating typeα）为 Zn／Cd／Ni／Co敏感型，受赠于德国Dietrich H.Nies教授。穿梭表达载体pYES2带有GAL1启动子，用于在酵母中高效表达SbMATE。

1.2 方法

1.2.1 SbMATE基因的克隆、测序及同源性分析

通过高通量的差异基因表达分析测序技术（DGE技术），我们鉴定了高粱根系中Zn缺乏下差异表达的基因，发现了一个MATE家族基因Sb04g031980显著受Zn缺乏的诱导，故命名为SbMATE。在NCBI核酸数据库中进行同源核苷酸检索，并进行蛋白质同源性比较，通过Treeview进行系统进化树分析。测序和引物合成由上海生工和北京中美泰和公司完成。

1.2.2 酵母菌株、质粒及酵母表达载体的构建

以HindIII／BamHI为酶切位点设计引物，分别 构 建 pYES2－SbMATE 和 pYES2－SbMATEGFP穿梭表达载体。并构建pYES2－GFP穿梭表达载体作为基因在酵母中亚细胞定位的对照。

采用醋酸锂法转化酵母菌株YK44，通过尿嘧啶营养缺陷培养基筛选阳性克隆，并通过菌落PCR进行鉴定。

在YPD培养基 （1%酵母浸提液、2%蛋白胨、2%葡萄糖，pH5.8）中添加响应浓度的重金属，进行胁迫处理试验。

1.2.3 酵母细胞中SbMATE亚细胞定位

将 转 化 pYES2－SbMATE－GFP 和 pYES2－GFP穿梭表达载体的酵母YK44阳性菌株，在激光共聚焦显微镜下观察GFP荧光，分析SbMATE在酵母细胞中的亚细胞定位情况。

1.2.4 酵母重金属耐受试验

YK44－pYES2、YK44－pYES2－ SbMATE 在SD－ura培养基中培养生长1d，OD600达到0.2，取100uL培养物接种到10mL SD－ura（2%半乳 糖）＋ CdCl2（0.01～0.05mmol·L－1）或ZnCl2（0.04～0.20mmol·L－1）或者CoCl2（0.1～0.5mmol·L－1）的含有不同浓度的重金属的培养基中，30℃，250r·min－1，培养36h后测定600 nm吸光值，试验取3个酵母阳性克隆，每个克隆做3个重复，取平均值并计算标准误差。

2 结果和分析

2.1 高粱SbMATE基因的克隆与相似性分析

为了分离和鉴定高粱中Zn响应的基因，通过深度测序技术，我们分析了高粱根系中差异表达的基因，发现了一个受Zn缺乏显著诱导的MATE家族转运蛋白基因Sb04g031980。序列分析表明，该片段长1 704bp，经DNAman软件分析，证明该序列编码了一个完整的读码框（图1），含有一个1 704bp的ORF，编码一个由567个氨基酸组成的蛋白质，分子量53.9kD。其蛋白含有两个MATE结构域，分别位于88～248bp和310～472bp处。我们将该基因命名为SbMATE。

MATE在生物体的生命活动中起着重要的作用，其结构和功能非常保守。将SbMATE（Sb04g031980）编码区序列经GenBankBlast比对后，发现与大多数高等植物MATE，如玉米、粟等同源性都很高，大于90%。其编码蛋白质一级序列更显示了其蛋白质的保守性，ClustalW分析（图2）显示该蛋白质与玉米GRMZM2G135175和小米Si016794m编码的蛋白质在其两个MATE结构域内同源性高于98%。在高粱的MATE家族中进化关系如图3所示，SbMATE（Sb04g031980）与另一个 MATE家族转运蛋白Sb06g025870位于同一个分支上。

图1 高粱SbMATE（Sb04g031980）基因及编码蛋白Fig.1 Gene and protein sequences of SbMATE（Sb04g031980）

图2 高粱MATE基因编码的氨基酸序列与其他植物MATE基因编码氨基酸序列比较Fig.2 Comparative analysis of protein sequence of SbMATE and their plant MATEs

图3 高粱MATE蛋白质序列系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of Sorghum MATE protein

2.2 pYES2－SbMATE 和 pYES2－SbMATE－GFP表达载体的构建、酵母转化及阳性克隆的筛选

为了进一步研究SbMATE在酵母细胞中的亚细胞定位，以及在重金属胁迫下的作用，将Sb－MATE经HindIII／BamHI双酶切后，插入pYES2的PGAL1之后，构建酵母表达载体pYES2－SbMATEGFP和pYES2－SbMATE，转化酵母。载体信息如图4，通过PCR分析鉴定阳性克隆，确认载体构建成功。

图4 pYES2－SbMATE、pYES2－SbMATE－GFP 和pYES2－GFP 表达载体图谱Fig.4 Vector profile of pYES2－SbMATE，pYES2－SbMATE－GFPand pYES2－GFP

2.3 SbMATE在酵母细胞中的亚细胞定位分析

利用 YK44－pYES2－SbMATE－GFP转基因酵母细胞，我们对SbMATE在酵母中的亚细胞定位进行了观察。如图5所示，SbMATE蛋白定位在酵母细胞的液泡中。

图5 SbMATE在酵母细胞中的亚细胞定位观察Fig.5 Subcellular localization of SbMATE in yeast cell

2.4 转SbMATE基因酵母重金属耐性分析

以转空载体pYES2的酵母为对照，分别用不同浓度的Zn、Co、Ni、Cd胁迫处理SbMATE转基因酵母菌株。如图6，结果表明，半乳糖诱导下，所有测试浓度的Ni、Co和Cd处理下的SbMATE转基因酵母生长状况均与对照差异不显著。但在0.05～0.10mmol·L－1ZnCl2处理下，SbMATE转基因酵母细胞的生长状况明显优于对照酵母细胞。这表明，SbMATE的过表达增强了酵母细胞对Zn毒害的耐受性。

图6 SbMATE在酵母细胞中的重金属耐性分析Fig.6 Heavy metal tolerance analysis of SbMATEin yeast cells

3 结论与讨论

最初发现，MATE家族基因在细胞解毒机制中起重要作用。例如，最早鉴定出的拟南芥MATE家族基因ALF5（At3g23560）是一个四甲铵转运蛋白［1］；而TT12（At3g59030）则编码一个类黄酮转运蛋白，该基因特异性地表达在胚珠和发育中的种子，将类黄酮转运至种子内表皮的液泡中［2］。近年来的研究发现，MATE家族中的一些蛋白在重金属离子的吸收、运输和累积中发挥重要作用。如FRD3（At3g08040）在根中特异性表达，该基因在根的木质部装载Fe螯合物，从而将Fe运输至地上部叶片中［3］。水稻MATE蛋白属于柠檬酸转运蛋白，研究发现，OsFRDL4受到Al的显著诱导，参与了植物对Al毒害的耐受性。在高粱中还发现一个MATE转运蛋白AltSB，在高粱对Al毒害的耐受性中也发挥着重要作用［7～10］。本研究从高粱Zn缺乏响应的差异表达的基因中获得了一个MATE家族基因SbMATE，通过GFP亚细胞定位研究发现，该基因定位在酵母细胞的液泡中。通过酵母重金属耐性分析研究发现，该基因增加了YK44酵母细胞对Zn毒害的耐受性，表明该基因在重金属耐受和累积过程中可能发挥重要作用。我们推测，定位于酵母液泡的SbMATE蛋白，可能通过将Zn吸收进酵母液泡中，从而降低了过量的Zn对细胞的毒害，因而提高了酵母细胞的耐受性。在今后的研究中，我们将进一步检测酵母细胞中的Zn含量，并在植物中通过构建过表达和抑制表达的转基因植株，验证该基因在植物Zn毒害和Zn缺乏响应中的功能。

［1］Diener AC，Gaxiola RA，Fink GR.Arabidopsis ALF5，a multidrug efflux transporter gene family member，confers resistance to toxins［J］.Plant Cell，2001，13（7）：1625－1638.

［2］Debeaujon I，Peeters AJ，Leon－Kloosterziel KM，et al.The Transparent Testa 12 gene of Arabidopsis encodes a multidrug secondary transporter－like protein required for flavonoid sequestration in vacuoles of the seed coat endothelium ［J］.Plant Cell，2001，13（4）：853－871.

［3］喻丝丝，魏林艳，谢华安，等.MATE转运蛋白在水稻抗逆作用中的研究进展［J］.福建农业学报，2014，29（4）：398－405.

［4］张玉秀，徐进，王校，等.植物抗旱和耐重金属基因工程研究进展［J］.应用生态学报，2007，18（7）：1631－1639.

［5］王志香，周光益，吴仲民，等.植物重金属毒害及其抗性机理研究进展［J］.河南林业科技，2007，27（2）：1003－2630.

［6］项长兴，董雅文，钱君龙，等.南京栖霞山铅锌矿区土壤环境质量评价［J］.土壤，1993，25（6）：319－322.

［7］Magalhaes JV，Liu J，Guimarães CT，et al.A gene in the multidrug and toxic compound extrusion（MATE）family confers aluminum tolerance in sorghum ［J］.Nat Genet，2007，39（9）：1156－1161.

［8］Xu J，Sun JH，Du LG，et al.Comparative transcriptome analysis of cadmium responses in Solanum nigrumand Solanum torvum ［J］.New Phytol，2012a，196：110－124.

［9］Xu J，Zhu YY，Ge Q，et al.Comparative physiological responses of Solanum nigrumand Solanum torvumto cadmium stress［J］.New Phytol，2012b，196：125－138.

［10］Shi DQ，Zhang Y，Ma JH，et al.Identification of Zinc Deficiency－Responsive MicroRNAs in Brassica juncea Roots by Small RNA Sequencing［J］.J Integrative Agriculture，2013，12（11）：2036－2044.