NNK联合LPS孵育对小鼠巨噬细胞增殖及相关基因表达影响

陈琛，卞晶晶，刘晓萍，张静，于忠杰，杨童茜

（青岛大学医学院组织胚胎学教研室，山东 青岛 266021）

越来越多的研究结果表明，炎性反应与肿瘤的发生发展密切相关。4－（甲基亚硝氨基）－3－吡啶－1－丁酮（NNK）是7种烟草烟雾中最强的致癌剂，经口腔、注射、气管支气管灌注等途径给予NNK，可成功建立肺癌模型［1］。脂多糖（LPS）是革兰阴性杆菌外膜的重要组成部分，是研究中广泛应用的致炎因子。近年来，有学者通过给予NNK和LPS联合刺激来制备肺癌动物模型。既往研究结果显示，LPS单独应用并不能诱发小鼠肺癌发生，当与NNK联合刺激时，NNK的致瘤效果明显增强［1］，但其机制尚不清楚。肺内的巨噬细胞是重要的免疫细胞，其在LPS和NNK联合刺激诱发肺癌过程中的变化报道甚少。活化的巨噬细胞至少包括M1、M2两种类型：M1型巨噬细胞可分泌肿瘤坏死因子α（TNF－α）、白细胞介素（IL）－1α以及IL－6等，并可使诱生型一氧化氮合酶（iNOS）表达升高；M2型巨噬细胞是一种抑制型细胞，可分泌IL－10、IL－4等抗炎因子，精氨酸酶（Arginase）高表达为其特征［2－3］。C－myc和核转录因子－κB（NF－κB）是重要的转录因子，其基因编码的转录产物与细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖及细胞周期进程密切相关［4］。C－myc基因在肺癌、宫颈癌、结肠癌、乳癌和胃癌等多种肿瘤组织过度表达［5］。本实验在体外研究LPS、NNK以及两者联合应用对小鼠巨噬细胞增殖及相关基因表达的影响，以探讨炎症促发癌症的机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

Raw264.7细胞购自美国ATCC公司，LPS购自美国Sigma公司，NNK购自美国Toronto Research Chemicals公司，RNA抽提试剂盒、cDNA逆转录试剂盒及RT－PCR试剂盒均购自美国Applied biosystems公司，TNF－α与IL－6酶联免疫试剂盒均购自美国eBioscience公司。细胞计数仪（Nexcelom Bioscience，Lawrence，MA）购自美国 Nexcelom Bioscience公司，7900HT快速实时定量PCR反应设备购自美国Applied biosystems公司。

1.2 引物合成

根据NCBI中的基因序列，应用Primer 5.0软件设计引物，引物由美国Operon公司合成，引物序列见表1。

1.3 实验方法

1.3.1 巨噬细胞培养及LPS、NNK浓度选择 将RAW264.7细胞置于含有体积分数0.1胎牛血清的DMEM培养液中，并添加105U／L青霉素和链霉素，置于37℃、含体积分数0.05CO2的培养箱中培养、扩增。取对数生长期细胞培养5h贴壁后，随机分为对照组、NNK组和LPS组。LPS组和NNK组分别加入10μg／L、250μg／L、1mg／L、4mg／L的LPS和5、10、25、100μmol／L的NNK，对照组加入等体积的无血清DMEM培养液，然后孵育Raw264.7细胞24h，每组设3个平行孔，实验重复2次。应用氯仿－异戊醇法抽提总RNA，逆转录为cDNA后进行实时定量PCR反应，结果以2△△Ct表示。

表1 PCR所用引物名称及其序列

1.3.2 巨噬细胞增殖能力检测 取指数生长期的Raw264.7细胞，以32×106／L接种于12孔板，培养5h后，随机分为对照组（A组）、NNK组（B组）、LPS组（C组）和LPS＋NNK组（D组），每组设3个平行孔。所用NNK浓度为10μmol／L，LPS浓度为1mg／L，对照组加入等体积的无血清DMEM培养液。培养24h后用细胞计数仪计数单位体积内细胞，判定细胞增殖状态。

1.3.3 巨噬细胞相关基因表达的检测 取对数生长期的Raw264.7细胞，培养5h贴壁后随机分组，分组及用药方法同1.3.2。孵育24h抽提RNA，进行实时定量 PCR 反应，检测 C－myc、NF－κB、Arginase、iNOS、IL－6和IL－1αmRNA 表达。每组设3个平行孔，实验重复2次。

1.3.4 巨噬细胞IL－6和TNF－α蛋白表达检测 取8×104个对数生长期的Raw264.7细胞接种于6孔板，培养5h，分组及用药同1.3.2。于培养24h收集细胞，提取样品蛋白，使用TNF－α与IL－6酶联免疫试剂盒定量检测IL－6和TNF－α蛋白含量。

1.4 统计学处理

采用Graphpad Prism 6.0统计软件进行分析。计量数据均以表示，应用析因设计的方差分析观察组间是否存在交互作用，析因结果存在交互作用时使用One way ANOVA检验进一步分析各因素的单独效应。以P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 LPS和NNK实验浓度选择

以浓度为10μg／L、250μg／L、1mg／L、4mg／L的LPS孵育Raw264.7细胞24h，细胞C－myc mRNA相对表达量分别为22.89±1.71、41.73±2.22、61.35±11.24、41.80±5.71；对照组细胞C－myc mRNA相对表达量为1.00±0.16。LPS可上调 Raw264.7细胞C－myc mRNA的相对表达量，其中浓度为1mg／L的LPS作用最显著（F＝605.6，P＜0.01）。5、10、25、100μmol／L的NNK孵育Raw264.7细胞24h，细胞C－myc mRNA的相对表达量分别为0.71±0.23、0.99±0.17、0.83±0.14、0.70±0.16，呈 下 降 趋势，但与对照组（1.00±0.16）相比差异无统计学意义。故选择1mg／L的LPS和10μmol／L的NNK用于下一步实验。

2.2 各组细胞增殖能力比较

C组Raw264.7细胞的增殖与A组相比差异有显著性（F＝5.28，q＝3.18，P＜0.05），而B组与 A组比较、D组与C组相比较差异均无显著性（P＞0.05）。见表2。

2.3 各组细胞相关基因表达比较

B组Raw264.7细胞各基因表达与A组比较，差异均无统计学意义。C、D组Raw264.7细胞各基因表达均较 A组显著升高（F＝19.4～5 895.0，t＝4.04～97.53，P＜0.05）。D组 C－myc mRNA 的表达显著低于C组（t＝4.80，P＜0.01），而 NF－κB和IL－1αmRNA的表达则均显著高于C组（t＝3.76、2.81，P＜0.05）。见表2。

2.4 各组细胞IL－6和TNF－α蛋白表达比较

B组细胞IL－6和TNF－α蛋白表达与A组比较差异无显著意义。C、D组细胞IL－6和TNF－α蛋白表达较 A组显著升高（F＝1 213.0、110.2，t＝29.40～44.76，P＜0.01）；D 组 TNF－α蛋白表达显著低于 C组（t＝3.74，P＜0.01）。见表3。

表2 各组小鼠巨噬细胞增殖及相关基因mRNA表达比较（n＝6，）

表2 各组小鼠巨噬细胞增殖及相关基因mRNA表达比较（n＝6，）

组别 细胞增殖（ccell／105·L－1） C－myc NF－κB iNOS Arginase IL－6 IL－1α A 组 7.00±0.63 1.00± 0.31 1.00±0.17 1.00± 0.16 1.00± 0.32 1.00± 0.24 1.00±0.26 B 组 7.17±0.89 1.00± 0.17 0.94±0.08 1.21± 0.38 1.06± 0.43 3.09± 0.50 0.97±0.36 C 组 5.02±0.26 61.35±11.24 4.85±1.40 539.50±113.00 28.45±10.70 67 143.00±16 146.00 3.19±0.25 D 组 5.85±1.04 37.79± 8.54 6.30±1.68 624.60±185.90 19.66±10.97 92 576.00±13 288.00 2.45±0.32

表3 各组细胞IL－6和TNF－α蛋白表达比较（n＝6，ρ／μg·L－1，）

表3 各组细胞IL－6和TNF－α蛋白表达比较（n＝6，ρ／μg·L－1，）

组别 IL－6 TNF－a A 组 1.512±0.239 3.368±0.142 B 组 1.613±0.364 3.392±0.500 C 组 38.510±2.290 42.770±6.211 D 组 34.920±3.430 33.110±4.670

3 讨 论

在癌症发展过程中炎症有两个方面的作用。一方面是杀灭肿瘤，在这种情况下，炎症诱导各种免疫细胞到达肿瘤位点，诱导肿瘤细胞及正常细胞凋亡。如果肿瘤细胞在此阶段被完全消除，炎症减弱且组织重塑，仅引发特定区域的急性炎症。另一方面可以刺激癌变，炎症可导致基因组的不稳定，造成基因突变。已有研究结果表明，炎症可以增加至少3个靶基因（Cmyc、Aurka和Pim1）的基因组不稳定和突变；肿瘤细胞可以在炎症环境下生存，慢性炎症通常可以提供有利于肿瘤发展的微环境，促进肿瘤生长或恶变［6］。

C－myc基因是myc基因家族的成员之一，属核内转录因子，其编码蛋白介导细胞外传入细胞内的生物信号向细胞核内传递，参与细胞增殖和细胞凋亡的调控［7－8］。C－myc在细胞静止期不表达，而在有丝分裂原作用下迅速表达，促使细胞增殖、浸润，最终细胞增殖异常而癌变［9－10］。已有研究证实，C－myc基因在肝细胞癌（HCC）组织中高表达，在癌旁组织中的表达明显下降，而在正常肝组织中则不表达，提示C－myc基因过度表达可能是诱发HCC的原因之一［11］。有研究表明，C－myc控制着45%的表型转化相关基因，参与巨噬细胞表型的转化，调控促癌基因的表达和细胞形态改变［8］。本文结果显示，浓度为5～100μmol／L的 NNK 对 Raw264.7细胞 C－myc mRNA表达和增殖无显著影响；LPS在10μg／L～4mg／L的浓度范围则可以显著上调Raw264.7细胞C－myc mRNA的相对表达量，以浓度为1mg／L的LPS作用最强。当LPS与NNK联合刺激时，小鼠Raw264.7细胞C－myc mRNA也呈高表达，但较单独LPS刺激的作用弱。同时，细胞的形态发生改变，胞核变大，细胞变大并伸出伪足状突起，呈现出活化状态。提示LPS与NNK联合刺激可能进一步促进了巨噬细胞的活化。

我们前期研究结果显示，应用不同浓度的炎性启动因子LPS体外孵育可以明显促进人肺腺癌上皮A549细胞的增殖，进一步提示LPS有激活肺癌细胞增殖的作用［12］。为进一步验证LPS和NNK联合孵育对巨噬细胞的作用，本实验分析了LPS和NNK对巨噬细胞 NF－κB、Arginase、iNOS、IL－1α、IL－6mRNA 和TNF－α、IL－6蛋白表达的影响。研究结果显示，单独NNK孵育对巨噬细胞相关基因和蛋白的表达无明显影响，而LPS孵育可显著刺激巨噬细胞高表达C－myc等相关基因和蛋白，提示LPS主要激活M1型巨噬细胞。当LPS＋NNK联合孵育Raw264.7细胞时，NNK 强化了 LPS激活 NF－κB、IL－1α基因的作用；促进了M1型巨噬细胞的激活，进而刺激M1型细胞产生和分泌IL－1α。这些炎性递质进一步刺激巨噬细胞过表达iNOS等，从而导致NO合成大大增加，导致正常细胞DNA的损伤，阻碍DNA修复，诱导基因突变，刺激肺癌形成。如果改变LPS或NNK的反应时间，是否还会发生同样的变化尚需进一步研究。

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