麦胚黄酮粗提物体外抗氧化及抑制非酶糖基化活性的研究

刘宛玲,龙俊敏,肖建辉,牛丽亚，*

(1.江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌 330045;2.江西生物科技职业学院动科系,江西南昌 330200)

麦胚黄酮粗提物体外抗氧化及抑制非酶糖基化活性的研究

刘宛玲1,龙俊敏2,肖建辉1,牛丽亚1，*

(1.江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌 330045;2.江西生物科技职业学院动科系,江西南昌 330200)

采用自由基清除体系(DPPH、羟基及超氧阴离子)、螯合金属离子能力、还原能力及总抗氧化能力体系评价麦胚黄酮粗提物的体外抗氧化活性,并考察麦胚黄酮粗提物对体外非酶糖基化反应的抑制作用。结果表明,麦胚黄酮粗提物清除自由基的能力、还原能力、总抗氧化能力均随浓度的增大而增强,且清除DPPH自由基、羟基自由基能力的IC50值分别为0.26、0.78 mg/mL。在浓度0.75～3.0 mg/mL之间,随浓度增大,其金属离子螯合能力逐渐增强至78.60%,继续增大浓度至3.75 mg/mL时,螯合能力降低至70.31%,但强于VC。此外,麦胚黄酮粗提物对体外蛋白质非酶糖基化终末产物(AGEs)的形成有抑制作用,且随浓度增大,抑制效果逐渐增强。1.0 mg/mL麦胚黄酮粗提物对AGEs生成的抑制率在第7 d可达到48%。综上可见,具有强体外抗氧化能力的麦胚黄酮,能有效抑制AGEs的生成。

麦胚黄酮粗提物,抗氧化活性,非酶糖基化终末产物

蛋白质非酶糖基化终末产物(Advanced Glycation End Products,AGEs)是在非酶促条件下,蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖(葡萄糖、果糖、戊糖等)的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生的产物。由于AGEs具有结构交联性和不可逆性,导致其在体内难以被降解,当AGEs在体内积累到一定程度时,会引发糖尿病病发症的发生,如肾病、视网膜病变、神经病变和动脉粥样硬化等[1-2]。

近年来研究发现,AGEs 致病的主要机制在于诱发细胞内活性氧的生成增多。广泛存在于多种蔬菜、水果和谷类食物中的黄酮类化合物,在具有强抗氧化性的同时,能有效抑制AGEs的形成。如Xiuyuan Zhuang[3]研究发现沙棘籽渣黄酮对总AGEs和戊糖素的形成都具有显著的抑制作用。

麦胚是面粉工业的副产品,虽在小麦籽粒中所占比例仅为1.4%～3.9%,但蕴藏着丰富的营养成分。麦胚中色素的主要成分是黄酮类化合物,包括黄酮、异黄酮、黄烷醇及其甙等一大类化合物,基本结构为5,7,4-三羟基-3,5-二甲氧基黄酮,具有抗肿瘤、防止动脉硬化等生理活性[4]。由于我国对于小麦胚芽资源利用起步较晚,对于麦胚黄酮的开发利用有待进行深入研究。那么麦胚黄酮的抗氧化性能如何？麦胚黄酮对AGEs的生成是否如其他已报道黄酮类化合物一样,具有抑制作用,值得探索。

本文通过研究麦胚黄酮粗提物的抗氧化性及对AGEs的抑制作用,以期能为其作为多功能化的食品基料进行开发利用,提供有用的科学依据,并为麦胚资源的充分利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦胚芽 购自郑州金苑面业有限公司;DPPH、菲啰嗪 购自北京中生瑞泰科技有限公司;总抗氧化(T-AOC)试剂盒 购自南京建成科技有限公司;氨基胍盐酸盐、牛血清白蛋白 购自北京百灵威科技有限公司;抗坏血酸 购自国药集团化学试剂有限公司;其余试剂均为分析纯 购自天津市福晨化学试剂厂。

TDL-5-A低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂;旋转蒸发器RE-5205 上海亚荣生化仪器厂;Scientz-10N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;V-5600型可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;970CRT荧光分光光度计 上海天美科学仪器有限公司;数显恒温磁力搅拌循环水箱 常州国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 麦胚黄酮粗提物的制备 参照杜敏华等[4]实验方法稍作修改,将小麦胚芽按料液比1∶8加入50%乙醇,50 ℃浸提4 h,重复三次,收集上清液,45 ℃旋蒸至无醇味,冷冻干燥,得到粉末,置于冰箱保存备用。麦胚黄酮粗提物得率为24%。

使用时,分别准确称取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g麦胚黄酮粗提物粉末,用50%乙醇溶解并定容至100 mL,得初始浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的麦胚黄酮粗提物样液。其中清除DPPH自由基实验样液初始浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL。

1.2.2 清除DPPH自由基能力测定 参照刘昊[5]实验方法稍作修改,2.0 mL样液加入2.0 mL 0.004% DPPH(50%乙醇溶液),混匀,室温避光反应30 min。以50%乙醇调零,517 nm处测定吸光度值A1,平行测定三次,取平均值。以2.0 mL 50%乙醇替代DPPH反应测吸光度值A2,以2.0 mL 50%乙醇替代样液反应测吸光度值A0。以终浓度分别为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL VC作阳性对照。

1.2.3 清除羟基自由基能力测定 参照刘昊[5]实验方法稍作修改,将2.0 mL样液、2.0 mL 0.75 mmol/L H2O2溶液、2.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、2.0 mL 3 mmol/L水杨酸混合,其中水杨酸最后加入启动整个反应,37 ℃水浴30 min后,4000 r/min离心5 min,50%乙醇调零,510 nm处测定吸光度值A1,平行测定3次,取平均值。以2.0 mL 50%乙醇替代水杨酸测吸光度值A2,以2.0 mL 50%乙醇替代样液测吸光度值A0。以终浓度分别为0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mg/mL VC作阳性对照。

1.2.4 清除超氧阴离子自由基能力测定 参照张福平等[6]实验方法稍作修改,取50 mmol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5 mL于试管中,加入2.0 mL蒸馏水,混匀后于37 ℃水浴加热20 min后,加入2.0 mL样液,再加入37 ℃已预热的25 mmol/L邻苯三酚0.5 mL,混匀后于37 ℃水浴中反应6 min,立即滴加1 mL 10 mmol/L的盐酸终止反应,50%乙醇调零,325 nm处测定吸光值A1,以0.5 mL 50%乙醇替代邻苯三酚测吸光度值A2,以2.0 mL 50%乙醇替代样液测吸光度值A0,平行测定3次,取平均值。以终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL VC作阳性对照。

超氧阴离子自由基清除率(%)

1.2.6 还原能力测定 参照Shumaila Jan等[8]实验方法稍作修改,2.0 mL不同浓度样液于试管中,加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液2.5 mL(pH6.6)和1%的铁氰化钾溶液2.5 mL,混匀,50 ℃水浴中反应20 min,快速冷却,再加入10%三氯乙酸(TCA)2.0 mL,混匀,4000 r/min离心10 min,移取上清液2.5 mL于试管中,加入0.1%的三氯化铁溶液0.5 mL、蒸馏水2.5 mL,充分混匀常温反应5 min后,50%乙醇调零,700 nm处测定其吸光度值A,平行测定三次,取平均值。以终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL VC作阳性对照。吸光度值越大表示还原能力越强。

1.2.7 总抗氧化性测定 使用总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒测定。机体中有很多抗氧化物质,能使Fe3+还原成Fe2+,后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物,通过520 nm比色可测出其抗氧化能力的高低。

1.2.8 抑制非酶糖基化活性实验 参照Zhenzhen Ni等[9]、王文君等[10]实验方法稍作修改,用0.2 mol/L,pH7.4的磷酸缓冲液分别配制浓度为20 mg/mL的牛血清白蛋白及0.5 mol/L葡萄糖。用50%乙醇分别配制初始浓度为0.4、2.0、4.0 mg/mL的样液。无菌条件下取三种浓度的样液各1.0 mL,分别与1.0 mL磷酸缓冲液、1.0 mL牛血清白蛋白溶液及1.0 mL葡萄糖溶液混合成样液终浓度为0.1、0.5、1.0 mg/mL的样品组,设三组平行。37 ℃水浴避光孵育,分别在1、2、3、4、5、6、7 d于发射波长355 nm,激发波长440 nm下,用荧光分光光度计测定荧光值F。以磷酸缓冲液替代样液做空白对照,测荧光值F0,以终浓度为0.1 mg/mL的氨基胍作阳性对照。根据下式计算麦胚黄酮粗提物对AGEs的抑制率。

2 结果与讨论

2.1 麦胚黄酮粗提物对DPPH自由基的清除能力

从图1可以看出,浓度0.25～2.0 mg/mL范围内,麦胚黄酮粗提物对DPPH自由基的清除率随浓度的增加而增大。在浓度为2.0 mg/mL 时,DPPH自由基清除率达到86.25%,半抑制浓度IC50值为0.26 mg/mL,可见麦胚黄酮粗提物对DPPH自由基有很强的清除作用。

图1 麦胚黄酮粗提物对DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical-scavenging activities of CFWG

2.2 麦胚黄酮粗提物对羟基自由基的清除能力

图2表明,麦胚黄酮粗提物对羟基自由基有一定的清除作用,且随着浓度的增大,清除作用增强。其清除羟基自由基的IC50值为0.78 mg/mL。申勇立等[11]通过研究漆树黄酮、毛地黄酮等几种典型黄酮类化合物与羟基自由基的反应机理,发现黄酮类化合物能通过不同位置未参与形成分子内氢键的酚羟基与羟基自由基发生反应。可见,麦胚黄酮粗提物也同样具有提供氢质子的能力,能起到清除或抑制自由基的作用。

图2 麦胚黄酮粗提物对羟基自由基的清除能力Fig.2 Hydroxyl radical-scavenging activities of CFWG

2.3 麦胚黄酮粗提物对超氧阴离子自由基的清除能力

图3表明,麦胚黄酮粗提物对超氧阴离子自由基具有一定的清除能力,且清除率与浓度呈线性相关。在浓度0.2～1.0 mg/mL范围内,麦胚黄酮粗提物对超氧阴离子清除率随浓度增加而显著增加,0.2 mg/mL时,清除率仅为8.44%,1.0 mg/mL达到45.39%,同浓度下VC对超氧阴离子自由基清除率均在91.07%以上,强于麦胚黄酮粗提物。

图3 麦胚黄酮粗提物对超氧阴离子自由基的清除能力Fig.3 Superoxide anion radical-scavenging activities of CFWG

2.4 麦胚黄酮粗提物螯合金属离子的能力

图4表明,麦胚黄酮粗提物有较强螯合金属离子能力,且在浓度0.75～3.0 mg/mL范围内,随着其浓度的增加,螯合能力逐渐增强,在3.0 mg/mL时螯合率达到78.60%,但在3.75 mg/mL时,螯合能力降低到70.31%。这可能与黄酮类化合物在高浓度时表现出抗氧化效果减弱或发生促氧化作用有关[12]。此外,从图中还可以看出,在此浓度范围内,EDTA与VC螯合金属离子能力均随浓度增大而增强,且EDTA螯合能力相对较强,均在94.32%以上。同一浓度下,麦胚黄酮粗提物螯合金属离子能力均强于VC而弱于EDTA。

图4 麦胚黄酮粗提物螯合亚铁离子的能力Fig.4 Ferric reducing antioxidant power of CFWG

2.5 麦胚黄酮粗提物的还原能力

图5表明,麦胚黄酮粗提物具有一定的还原能力,是良好的电子供应者,其提供的电子可以使Fe3+还原成Fe2+。在浓度0.1～0.5 mg/mL范围内,随浓度增大,还原能力缓慢增强,两者呈良好的线性关系。但与同浓度的VC相比,麦胚黄酮粗提物的还原能力较弱。

图5 麦胚黄酮粗提物还原能力Fig.5 Reducing capacity of CFWG

2.6 麦胚黄酮粗提物的总抗氧化能力

图6表明,麦胚黄酮粗提物的总抗氧化能力在0.12～0.60 mg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系,0.60 mg/mL麦胚黄酮粗提物的总抗氧化能力为2.5 U/mL。可见,麦胚黄酮这一类谷物黄酮,与已报道的植物黄酮一样,都具有较好的抗氧化性[7-8],具有开发潜力。

图6 麦胚黄酮粗提物总抗氧化能力Fig.6 Total antioxidant capacity of CFWG

2.7 麦胚黄酮粗提物抑制非酶糖基化活性

图7表明,麦胚黄酮粗提物对体外蛋白质非酶糖基化终末产物有一定的抑制作用,随时间的延长,荧光强度逐渐增强,抑制率逐渐增大,第2～3 d急剧增大。且随浓度增大,抑制效果也逐渐增强。浓度为1.0 mg/mL的麦胚黄酮粗提物第7 d对AGEs的抑制率达到了48%,相当于0.1 mg/mL氨基胍第3 d的抑制效果。Xiuyuan Zhuang等人研究多种植物提取物对AGEs形成的抑制作用时发现,黄酮类化合物对AGEs的形成具有较好的抑制效果[3]。本文在发现麦胚黄酮粗提物在体外具有较好抗氧化性的同时,也首次发现了其具有抑制AGEs形成的作用。

图7 麦胚黄酮粗提物对非酶糖基化终末产物AGEs形成的影响Fig.7 Effect of CFWG on non-enzymatic glycation end-products AGEs formation

3 结论

结果表明,麦胚黄酮粗提物有较好的抗氧化能力,尤其是对DPPH自由基,具有较强的清除活性。同时其对蛋白质非酶糖基化终末产物AGEs形成有一定抑制作用,终浓度为1.0 mg/mL的麦胚黄酮粗提物对AGEs生成的抑制率在第1 d为6.7%,到第7 d达到48.25%。且抗氧化及抑制AGEs能力与麦胚黄酮粗提物在一定浓度范围内均呈明显的量效关系。

综上可见,麦胚黄酮粗提物具有较强的生物活性,尤其是对AGEs的抑制作用,对于缓解AGEs积累引起的糖尿病并发症,具有巨大的开发潜力。

[1]Vijaya Lakshmi Bodiga,Sasidhar Reddy Eda,Sreedhar Bodiga,et al. Advanced glycation end products:role in pathology of diabetic cardiomyopathy[J]. Heart Failure Reviews,2014,19:49-63.

[2]V. Jakuš,N. Rietbrock. Advanced glycation end-products and the progress of diabetic vascular complications[J]. Minireview,2004,53:131-142.

[3]Xiuyuan Zhuang,Wen Zhang,Xiufeng Pang,et al. Combined effect of total flavonoids from seed residues of Hippophae rhamnoides L. and zinc on advanced glycation end products-induced endothelial cell dysfunction[J]. Food Chemistry,2012,133(3):905-911.

[4]杜敏华,田龙.大孔吸附树脂分离纯化麦胚黄酮工艺研究[J].中国粮油学报,2007,22(3):126-130.

[5]刘昊.芒果黄酮的提取分离及抗氧化活性的研究[D].南宁:广西大学,2012.

[6]张福平,汤艳姬,刘晓珍,等.黄皮叶黄酮类化合物的抗氧化研究[J].南方农业学报,2013,44(8):1343-1246.

[8]Shumaila Jan,Muhammad Rashid Khan,Umbreen Rashid,et al. Assessment of Antioxidant Potential,Total Phenolics and Flavonoids of Different Solvent Fractions of Monotheca Buxifolia Fruit[J]. Osong Public Health and Research Perspectives,2013,4(5):246-254.

[9]Zhenzhen Ni,Zhengbing Zhuge,Wenlu Li,et al. Inhibitory Effects of Hydroxysafflor Yellow A on the Formation of Advanced Glycation End ProductsinVitro[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin,2012,35(11):2050-2053.

[10]王文君,欧阳克蕙,许文凤,等.9种植物粗多糖体外降脂及抑制非酶糖基化活性的研究[J].江西农业大学学报,2013,35(3):593-597.

[11]申勇立.羟基自由基破坏DNA与RNA的碱基、黄酮类化合物清理羟基自由基反应机理的量子化学研究及电子密度拓扑学分析[D].天津:南开大学,2009.

[12]徐雅琴,李静,于泽源,等.黑穗醋栗总黄酮的抗氧化及抗非酶糖基化活性研究[J].东北农业大学学报,2013,4(2):59-63.

Study on the antioxidant and inhibiting non-enzyme glycation activities of crude flavonoids from wheat germinvitro

LIU Wan-ling1,LONG Jun-min2,XIAO Jian-hui1,NIU Li-ya1,*

(1.School of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;2.School of animal science,Jiangxi Biotech Vocational College,Nanchang 330200,China)

In this paper,the antioxidant activities of crude flavonoids from wheat germ(CFWG)invitrowere determined by radical scavenging system(DPPH radicals,hydroxyl radicals,superoxide anion),metal ion chelating ability,reducing power and total antioxidant capacity system. In addition,the inhibiting non-enzymatic glycation reaction of CFWG was also evaluated. The results showed that,with the increasing of concentration,the antioxidant activities of CFWG,such as scavenging DPPH radicals,hydroxyl radicals and superoxide anion radicals ability,and reducing power,total antioxidant capacity were increased. The IC50values of scavenge DPPH radical and hydroxyl radicals were 0.26,0.78 mg/mL,respectively. In concentration of 0.75～3.0 mg/mL,with the concentration increased,its metal ion chelating ability was gradually increased to 78.60%,and when the concentration was 3.75 mg/mL,its metal ion chelating ability was reduced to 70.31%,which was also stronger than VC. Furthermore,CFWG can inhibit the advanced glycation end products(AGEs)invitro,and with the concentration increasing,the inhibitory effect was gradually increasd. In the first seven days,the inhibition rate of 1.0 mg/mL CFWG was up to 48%. In a word,CFWG with strong antioxidant capacityinvitro,can inhibit the formation of AGEs effectively.

crude flavonoids from wheat germ;antioxidant activity;advanced glycation end products

2014-12-15

刘宛玲(1988-)，女，硕士研究生，研究方向：天然产物提取及其功能性研究，E-mail：liuwanling1990@126.com。

*通讯作者:牛丽亚(1984-)，女，博士，讲师，研究方向：功能性食品，E-mail：nly8483@163.com。

国家自然科学基金资助项目(31401484)；江西省青年科学基金计划(20142BAB214002)。

TS209

A

1002-0306(2015)23-0059-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.003