针刺捻转补泻手法对自发性高血压大鼠RAS的影响

田艳鹏 王朝阳 孙静文 金娜美 郭 妍 刘清国

(北京中医药大学针灸推拿学院，北京，100029)

高血压作为一种常见的心脑血管疾病，具有较高的发病率和致死率，严重危害着人类的健康。随着经济的发展和人类生活水平的提高，以及体力活动的逐渐缺乏，超重肥胖率不断增高。此外，当今社会生活和工作压力大，应酬增多，饮食结构严重不合理，吸烟、饮酒也成为许多人生活中不可或缺的一部分。研究表明，较大的生活心理压力、肥胖、吸烟、酗酒以及不合理的饮食均与高血压的发生有着不可分割的关系。治疗高血压要以最大限度地降低心脑血管病的病死率和致残率为目标。降压药物的应用以及采用非药物方法如控制体重、限盐、限酒以及增加体力活动等，使血压水平得到一定程度的控制，但与血压密切相关的其他心脑血管疾病如心衰、心梗、脑卒中和肾脏疾病等的发病率却没有明显下降，相反，部分疾病发病率呈逐年上升趋势，究其原因是由于血压控制不理想和未重视对靶器官的保护。所以寻找一种能够有效降低血压水平并能保护靶器官的治疗方法迫在眉睫。

课题组前期已进行了大量的研究，探讨捻转补泻手法对血压调控的可能机制，证实了针刺治疗高血压的有效性以及捻转补法和泻法生物效应的差异性。如王丽等［1］发现针刺泻法可使应激性高血压大鼠血清去甲肾上腺素(Noradrenaline，NE)、5-羟色胺(5-Hydroxy Tryptamine，5-HT)含量下降，血浆及下丘脑内皮素(Endothelia，ET)含量下降，认为针刺对应激性高血压大鼠血压的调节与中枢和外周ET、血清NE、5-HT含量变化有关，其机制是外周交感神经系统、血管内皮功能系统共同作用的结果。但有关捻转补泻手法对高血压靶器官保护作用机制的研究尚不够充分。本实验通过观察针刺捻转补泻手法对SHR大鼠血浆及肾组织中肾素、AngⅡ的影响，探讨捻转补泻手法对高血压肾损害的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性12周龄SHR大鼠60只，WKY大鼠12只，体重200～250 g，均购于北京维通利华实验动物养殖中心(清洁级)，饲养于北京中医药大学针灸推拿学院动物室。

1.1.2 实验器材 中研太和牌一次性无菌毫针0.16 mm×7 mm，无锡佳健医疗器械有限公司生产;动物无创血压测试仪(BP-6)，成都泰盟生物仪器有限公司提供;ELISA定量检测试剂盒(肾素、AngⅡ)，慧佳生物科技有限公司提供。

1.2 动物分组 按照随机数字表，将SHR大鼠60只随机分为5组，每组12只，分别为模型对照组(A)、针刺留针组(B)、捻转补法组(C)、捻转泻法组(D)、平补平泻组(E)。WKY大鼠12只作为空白对照组F。适应性饲养1周后开始实验。

1.3 取穴及干预方法

1.3.1 取穴 选取太冲穴作为针刺穴位，于后肢足背1、2 趾骨间凹陷处取穴(《实验针灸学》［2］)。

1.3.2 干预方法 实验动物适应性饲养1周后开始治疗。将各组大鼠放入提前准备好的鼠袋中，露出双侧后肢，直刺单侧太冲穴1～2 mm，每日左右两侧交替针刺。治疗周期为28 d，每日上午治疗1次，时间集中在8:00—11:00，每隔6 d休息1 d，共治疗24次，所有针刺操作由专人负责完成。施行手法时，以节拍器辅助控制捻针频率和时间，将节拍器发音频率设定为:1 min，60次/min。针刺处理方法如下:A、F组:只做与其他组相同的抓取刺激，不做针刺处理。B组:针刺“太冲穴”，留针10 min，期间不做任何处理。C组:针刺“太冲穴”并用捻转补法，以右手为刺手，大拇指作用力向前用力捻转，然后轻力退回，捻转幅度 360°/次，60次/min，持续捻针2 min，留针10 min。D组:针刺“太冲穴”并用捻转泻法，以右手为刺手，大拇指作用力向后时用力捻转，然后轻力向前退回，捻转幅度360°/次，60次/min，持续捻针2 min，留针10 min。E组:针刺“太冲穴”并用平补平泻法，以右手为刺手，大拇指向前捻转和向后捻转作用力相同，捻转幅度360°/次，60次/min，持续捻针2 min，留针 10 min。

1.4 指标检测

1.4.1 测量血压 室温(22±2)℃条件下，将无创血压仪预热，并恒定在35℃(用温控器调节温度恒定)约15 min，测量大鼠安静清醒状态下尾动脉收缩压和舒张压，连续测量3次，取其均值。测量时间点:针刺前1天和针刺治疗开始后的第3、6、10、13、17、20、24、27天。正式测压前训练若干次。测压过程注意事项:操作者动作轻柔，以免因激惹大鼠而导致其血压波动;实验室环境要保持安静;加温时间不能太长，要固定在15 min左右;大鼠网套及尾套尺寸大小均要合适，以防逃脱。测量过程中由于温度控制不当，导致空白组大鼠死亡2只。

1.4.2 肾素、AngⅡ的测定 动物清醒状态下，断头，取10 mL抗凝管接取主动脉血5 mL，静置30 mim后，于4℃、3 000 r/min离心10 min，分离血浆，-20℃下保存待测定。采用ELISA法测定血浆中肾素、AngⅡ。操作程序严格按说明书进行。动物断头后，暴露腹腔，迅速摘取右侧肾脏，修块，4℃生理盐水冲洗，滤纸吸干，在冰浴中制成匀浆，4℃、3 000 r/min离心20 min，取上清液。采用ELISA法测定肾组织中肾素、AngⅡ。操作程序严格按说明书进行。1.4.3 肾组织病理学观察 动物断头后，暴露腹腔，迅速剪取大鼠左侧肾脏，修块，用10%中性甲醛液固定24 h，然后分别用乙醇和二甲苯脱水，石蜡包埋切片4～5μm，伊红和苏木精(HE)染色，光镜观察肾组织病理学改变。

1.5 统计方法 实验结果采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。计量数据以(¯x±s)表示。组间差异如方差齐则采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，两两比较用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后各组大鼠血压的变化 治疗前SHR组大鼠收缩压和舒张压差异无统计学意义(P＞0.05);与F组比较，SHR组大鼠收缩压和舒张压均显著升高(P＜0.01)。治疗28 d后，F组大鼠收缩压升高，与治疗前比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而舒张压与治疗前比较差异无统计学意义(P＞0.05);A组大鼠收缩压与舒张压与治疗前、B、C、E组比较差异有统计学意义(P＜0.05);B、C、E组大鼠治疗前后收缩压和舒张压无明显变化(P＞0.05);D组大鼠收缩压和舒张压与治疗前比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，与 A、B、C、E、F 组比较差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。见表1。

表3 针刺对肾组织中肾素、AngⅡ含量的影响(¯x±s，pg/mg)

表1 各组大鼠血压的变化(¯x±s，mmHg)

表2 针刺对血浆中肾素、AngⅡ含量的影响(¯x±s，ng/L)

2.2 血浆中肾素、AngⅡ含量的变化 血浆肾素含量，A组与F组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，与B、C、E组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。D组血浆肾素含量明显降低，与A、B、C、E组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，与F组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。血浆AngⅡ含量，A组与F组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，与B、C、E组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。D组血浆AngⅡ含量明显降低，与A、B、C、E组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，与F组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

图1 HE染色法观察肾组织病理学变化(×200)

2.3 肾组织中肾素、AngⅡ含量的变化 肾组织肾素含量，A组与F组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，与B、C、E组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。D组肾组织肾素含量明显降低，与A、B、C、E组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，与F组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。肾组织AngⅡ含量，A组与F组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，与B、C、E组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。D组肾组织AngⅡ含量明显降低，与A、B、C、E组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，与F组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

2.4 肾组织病理学变化 光镜下观察各组大鼠肾组织病理学切片，F组大鼠肾组织结构基本正常。A与B、C、E组均有不同程度肾小球系膜基质增生，肾小球硬化;肾小管基膜不规则增厚，并出现萎缩;肾间质纤维化;肾小动脉管壁增厚。且A组病变程度较其他各组略重。D组血管结构基本正常，肾小球及肾小管结构基本正常。见图1。

3 讨论

肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin System，RAS)是人体重要的体液调节系统，由多种激素和相关的酶类组成。它的主要功能是调节人体血压、水和电解质的平衡，保持内环境的相对稳定。循环和组织中都有RAS的存在，两者均能参与对靶器官的调节。随着研究的深入和分子生物学的进展，进一步证实了在心脏、肾脏、肾上腺、脑以及周围血管中均有组织RAS存在［3］，使得人们对RAS在高血压发病中的作用有了更深入的了解。

高血压的发生与循环 RAS分泌过多有关［4］。局部RAS分泌后，通过自分泌、旁分泌的方式在局部组织细胞中发挥作用。过度激活的RAS与高血压的发生、发展以及心血管肥大和重构密切相关［5］。

AngII在RAS中发挥着重要作用。RAS通过AngII强有力的缩血管作用和醛固酮(ALD)的水、钠潴留作用，在高血压形成机制中发挥重要作用［6］。AngII引起血压升高的途径有:1)直接作用于血管紧张素受体(AT1)，使小动脉平滑肌收缩;2)刺激肾上腺皮质球状带，使醛固酮分泌增加，增加水钠潴留;3)刺激交感神经末梢，使去甲肾上腺素分泌增加等［7］。AngII不仅具有收缩血管的作用，并可通过氧化激活和炎症反应诱导高血压发生［8-9］。此外，血压的昼夜节律模式受血浆肾素活性和醛固酮水平的影响［10］，而血浆肾素活性和醛固酮水平还可能参与高血压靶器官的损害［11］。肾脏既是调节血压的重要器官，又是高血压的主要靶器官之一。高血压病早期即存在肾小管近端重吸收功能损害［12］。长期高血压又可以导致肾小动脉及微动脉硬化，管壁增厚、管腔狭窄，最终造成肾小球硬化和间质纤维化［13］，直至尿毒症而死亡。AngII可以直接收缩肾小动脉，增加肾小球毛细血管阻力，还可作用于肾小球血管间质细胞上的AT1受体，使转化生长因子(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)的表达增加，平滑肌增生，或促进肾小球血管间质细胞的增生和基质的生成，最终导致肾小球的损伤和硬化。可见，AngII是高血压引起肾小球硬化的主要因子［14］。

本实验通过观察针刺捻转补泻对SHR大鼠RAS的影响，探讨捻转补泻手法对SHR大鼠肾脏保护的作用机制。实验结果可以得出以下结论:捻转泻法能有效地降低12周龄SHR大鼠血压水平，降低SHR大鼠血浆及肾组织肾素、AngⅡ的含量;捻转泻法能有效降低SHR大鼠血压水平，减轻高血压肾损害，其作用机制可能是:捻转泻法能够有效降低SHR大鼠血浆及肾组织肾素、AngⅡ含量，减少RAS在高血压肾损害中发挥作用;本实验所采用的捻转补泻手法存在效应的差异。肾小球入球动脉的球旁细胞分泌肾素，激活从肝脏产生的血管紧张素原，生成Ang I，然后经肺循环的血管紧张素转化酶作用，生成AngII。这是AngII生成的“经典通路”，也是循环AngII的主要来源。有研究表明［15］，SHR大鼠AngII显著升高。实验中发现，SHR大鼠血浆肾素水平显著升高，可以推断由于SHR大鼠血浆肾素水平升高，经过上述经典通路可以最终导致AngII含量升高，而AngII是导致SHR大鼠血压升高最主要的效应物质。所以通过调整血浆肾素水平可以间接对血压水平实施控制。实验中还发现，针刺捻转泻法可以有效降低SHR大鼠血浆肾素水平。而与捻转补法组、平补平泻组、针刺留针组比较，模型组对照组大鼠血浆肾素水平明显升高(P＜0.01)，在前期理论的基础上，进一步证实了针刺具有使机体功能亢进者降低，低下者增高，不平衡者趋于相对平衡的良性调节作用。由于SHR大鼠血浆肾素水平升高，所以针刺具有使其降低的作用，但皆不如捻转泻法效果好，这是因为本实验所采用的SHR大鼠基本符合中医肝阳上亢的特征，属实证，故泻法降低血浆肾素水平的效果最好。实验中发现，SHR大鼠肾组织肾素水平也显著升高，捻转泻法能够有效地降低SHR大鼠肾组织肾素水平。说明血压的升高与肾组织肾素水平也有一定的关系。可见，肾组织RAS不仅与局部组织的生长和分化密切相关［16］，还可能参与了对血压的调控。实验还发现，SHR大鼠血浆AngII水平明显升高，这与以往大多数实验研究结果相符。如前所述，肾组织RAS不仅能够调节局部组织的生长和分化，可能还参与了对血压的调控。肾组织RAS存在于肾小管、肾小动脉和直血管。由近端肾小管产生肾素，经肾小管腔或间质被摄取，进入近端肾小管细胞胞浆。肾组织RAS对肾功能的调节具有重要作用。AngII首先作用于近端肾小管近端的AngII受体，调节钠的吸收和PH，对钠的自体稳定具有重要作用。而在血管部位的RAS则影响肾小球的血流动力学以及肾小管、肾小球的反馈机制。肾血流减少时，AngII优先使输出小动脉收缩，增加肾小球的静水压和滤过率，从而肾小球的滤过率保持相对稳定。实验发现，SHR大鼠肾组织AngII水平明显升高，而捻转泻法能有效降低SHR大鼠肾组织AngII水平，与预期结果相符。与捻转补法组、平补平泻组、针刺留针组比较，模型对照组大鼠肾组织AngII水平显著升高(P＜0.01)。可见，血压的升高与循环和组织中RAS的激活有关，而针刺对血压的调节和对靶器官的保护作用也与RAS系统密切相关。

综上所述，针刺捻转泻法能够有效地降低SHR大鼠血压水平、血浆及肾组织肾素、AngⅡ含量，减轻高血压肾损害。在高血压的治疗过程中，减少高血压靶器官损害至关重要，本实验仅从SHR大鼠RAS的变化来探讨捻转补泻手法对高血压靶器官损害的保护作用机制，更多的作用机制尚需进一步探索。本研究的创新点在于将研究捻转补泻手法的降压效应，扩展到研究捻转补泻手法同时具有保护和逆转靶器官损害的作用，为探索新的高血压防治靶点提供理论依据。

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