NGF重组腺病毒在螺旋神经节细胞中的转染特性

池 君，宋武战，范泉水，张学渊，刘 丹，游建军

研究表明，螺旋神经节细胞中存在着微量的神经生长因子（nerve growth factor,NGF），其细胞中亦分布着NGF的高效受体TrkA[1-2]，NGF要通过与其受体TrkA结合，启动细胞内的信号途径而发挥保护神经元、促进神经元存活等作用。由于耳蜗螺旋神经节细胞（spiral ganglion neurons，SGNs）在听觉损伤和恢复中发挥重要作用，如何利用转基因技术提高细胞中NGF含量，使SGNs能在耳蜗内长期存活，将为感音神经性耳聋的基因治疗提供新的途径。本实验将外源性NGF通过腺病毒导入SGNs中，观察转染后SGNs的变化和存活时间。

1 材料与方法

1.1 动物及材料 选用出生后3 d健康的SD大鼠10只（20耳）（购自昆明医学院实验动物中心，许可证号SYXK2005-0004），雌雄不限。随机分成两组，每组5只（10耳）。A组为NGF重组腺病毒转染组，B组为非转染组。携带有小鼠NGF基因的重组腺病毒制备参考文献[3]。

1.2 腺病毒转染离体培养的螺旋神经节细胞 耳蜗螺旋神经节细胞的分离、培养参考文献[4]。A组中，当螺旋神经节细胞培养至第 时，将 孔板中原有的培养液吸出一半，加入500 μl腺病毒液；37℃5%CO2细胞培养箱中孵育2 h，再加入新的细胞培养液；48 h后半量换液；B组不加入病毒液，培养同前。每天观察细胞形态和荧光变化，两组细胞均培养14 d。

1.3 蛋白质免疫印迹检测转染前后SGNs中NGF的变化 终止培养后，A、B两组分别行蛋白质免疫印迹检测。按常规制备10%的SDS-PAGE凝胶，上样后电泳，5%积层胶中电压为80 V，样品进入分离胶后电压调至120 V；电泳完毕后，将凝胶上的蛋白质电转至硝酸纤维素膜（NC）上。丽春红染色观察是否有蛋白质条带，然后进行下一步操作。……