巴西橡胶树乳管细胞中5个橡胶合成关键酶基因节律性表达研究

杨鹏等

摘 要 以巴西橡胶树无性系PR107、RRIM600、CATAS7-33-97和CATAS8-79的未开割树为材料，采用荧光定量PCR技术，分析乳管细胞中HMGR1、FDPS、SRPP、REF和HRT2等5个橡胶生物合成关键酶基因的昼夜表达模式。结果表明：5个基因的表达均具有节律性，而且不同基因在同一无性系中以及同一基因在不同无性系间的节律性表达模式都有一定程度的差异。结果为分析不同环境因素对橡胶生物合成相关酶基因节律性表达的影响具有一定参考价值。

关键词 巴西橡胶树；胶乳；橡胶生物合成相关酶；节律性表达

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Rhythmic Expression of Genes Encoding Enzymes for

Rubber Biosynthesis in Rubber Trees

YANG Peng1，2， ZHANG Shixin2， CHEN Huiping1， TIAN Weimin1，2 *

1 College of Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Rubber Research Institute， CATAS/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture/State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation and Physiology of Tropical Crops， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract The day and night expression pattern of FDPS， SRPP， HMGR1， REF and HRT2 encoding the enzymes for rubber biosynthesis in rubber tree clones（PR107， RRIM600， CATAS7-33-97and CATAS8-79）were analyzed by quantitative PCR technique. The expression of all the five genes appeared to be day and night rhythm. The rhythmic expression pattern was different to some extent either among different genes in the same clone or among different clones for the same gene. This is valuable for investigating the effects of environmental factors on the rhythmic expression of genes encoding the key enzymes for rubber biosynthesis in rubber tree.

Key words Hevea brasiliensis Muell. Arg.； Latex； Key enzymes for rubber biosynthesis； Rhythmic expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.007

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）是天然橡胶的主要来源，而天然橡胶生物合成是典型的植物类异戊二烯代谢途径，有多种酶类参与，如HMG-CoA还原酶1（3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase 1， HMGR1）、法尼基焦磷酸合成酶（Farnesyl Diphosphate Synthase， FDPS）、小橡胶粒子蛋白（Small Rubber Particle Protein， SRPP）、橡胶延伸因子（Rubber Elongation Factor， REF）和橡胶转移酶（Rubber Transferase， HRT）等。目前对这些酶的研究较多：HMGR催化由HMG-CoA形成甲羟戊酸（Mavalonic acid， MVA），继而合成异戊烯焦磷酸（IPP）[1]，在烟草中表达HMGR1、HMGR2基因，导致甾醇的含量增加[2-3]，在小粒种咖啡（Coffea arabica）中，HMGR1表达存在时间差异性[4]；FDPS催化一分子二甲基丙烯焦磷酸和两分子异戊烯基焦磷酸以1、4头尾连续缩合反应，而形成法尼基焦磷酸（FPP）[5]，橡胶生物合成的效率与细胞内的FPP浓度呈正相关[6]；FDPS在植物中起到甾醇合成和三萜类生物合成的调节作用[7]；SRPP和REF是橡胶粒子膜蛋白，两者与脂质膜的结合方式不同，REF嵌入到半个单位膜中，SRPP仅结合在膜的表面[8-9]，REF的表达与橡胶合成量成正相关[10]，在蒲公英中，SRPP对橡胶合成效率和橡胶合成稳定性具有非常关键的作用[11-12]；HRT1和HRT2在橡胶树的胶乳中特异表达[13]，在俄罗斯蒲公英中，HRT参与橡胶合成[14]。

生物节律在植物生命过程中扮演着重要的角色，是植物对环境的一种适应性机制[15-16]，这种生物节律在分子水平上表现为基因的节律性表达[17]。模式植物拟兰芥大约有1/3基因属于时钟调节基因[18]。由于橡胶生物合成关键酶基因不是典型的时钟基因，所以几乎所有关于环境因素对橡胶生物合成关键酶基因表达的研究都没有考虑基因的节律性表达。因此，本文以橡胶树无性系品系PR107、RRIM600、CATAS7-33-97和CATAS8-79的4 a未开割树为材料，采用荧光定量PCR技术，分析5个橡胶生物合成关键酶基因的昼夜表达模式，以期为基因表达分析研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

巴西橡胶树无性系PR107、RRIM600、CATAS7-33-97和CATAS8-79的4 a未开割树，种植于中国农业科学院橡胶研究所试验基地。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 选取大小和长势一致的3株PR107植株，采用针刺法从主干不同部位收集胶乳。第一个部位距芽接桩30 cm，从该部位往上，以正面-背面交错方式再选取8个部位，相邻位置间相隔15 cm，同时在9个位置用针刺法采集胶乳样品。每株树每个部位的胶乳分别提取总RNA，通过荧光定量PCR分析基因在树干不同部位的表达。

选取6株大小和长势较一致的PR107植株，其中，3株作针刺处理，3株为对照。针刺处理的部位距离芽接桩30 cm。针刺处理4 h 后，在处理位置上方15 cm处的树干背面采集胶乳。对照组在对应高度采集胶乳。每株树的胶乳分别提取总RNA，通过荧光定量PCR分析针刺处理对临近部位基因表达的影响。

分别从4个无性系中选取3株大小和长势一致的植株，分别在6 ： 00、10 ： 00、14 ： 00、18 ： 00、22 ： 00、次日2 ： 00、次日4 ： 00、次日6 ： 00、次日10 ： 00等9个时间点，用针刺法由下往上从树干的9个部位采集胶乳。每株树的每个部位的胶乳分别提取总RNA，通过荧光定量PCR分析基因的昼夜表达模式。

1.2.2 胶乳中总RNA提取与反转录 使用天根生化科技（北京）有限公司多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DP441）提取胶乳总RNA，方法参照试剂盒说明书。提取的胶乳总RNA通过琼脂糖凝胶电泳检测完整性并使用美国Thermo Electron Corporation的微量紫外分光光度计（Gene company Limited NO2000）测定浓度，各取800 ng RNA进行等量反转录，方法参照试剂盒（#K1621）说明书。

1.2.3 荧光定量PCR 将反转录产物稀释10倍作为模版，使用美国Bio-Rad Laboratories， Inc.的CFX96/384 Touch Real-Time PCR Detection System进行荧光定量PCR分析。使用宝生物工程（大连）有限公司的SYBRR Premix Ex TaqTM II（RR820A）配制反应体系，以HbACTIN为内参基因。荧光定量PCR反应体系见表1。引物序列及扩增效率见表2。

荧光定量PCR反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，62 ℃/63.3 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40个循环；95 ℃ 10 s；60～95 ℃做熔解曲线分析，每个温度以每步0.2 ℃上升，每个温度停留5 s。

1.2.4 数据分析 使用SAS8.1 软件进行数据统计分析。采用One-way ANOVA 中的Duncan多重对比分析不同数据组间的差异。

2 结果与分析

2.1 橡胶树树干不同高度的胶乳中基因表达分析

荧光定量PCR分析结果表明，HMGR1、FDPS、SRPP、REF和HRT2等5个基因在树干不同部位的表达存在一定程度的差异（图1），这可能与砧木的不同导致株间差异有关。但通过SAS软件进行单样本T检测，这些差异并未达到显著水平。

2.2 针刺处理对邻近部位橡胶合成相关基因表达的影响

离芽接桩30 cm处的树干部位作针刺处理，4 h后在距离处理位置15 cm处的树干背面采集胶乳。对照不作任何处理，在相应高度处采集胶乳。结果表明，HMGR1、FDPS、SRPP、REF和HRT2等5个基因表达量在处理和对照间存在一定程度的差异，但差异不显著（p>0.05）（图2）。

2.3 不同基因在同一无性系中的表达分析

在无性系PR107中，胶乳中的5个基因在白天的表达呈上升趋势，到18 ： 00达到最高峰，随后在22 ： 00开始下调。但是表达量处于低谷的时间点存在一定差异，其中，HMGR1和FDPS的低谷出现在第2天10 ： 00，而SRPP、REF和HRT2的表达最低点在第2天06 ： 00。在RRIM600中，5个基因在白天都持续上调表达，但是，表达高峰出现的时间点存在差异。HMGR1和FDPS的表达高峰出现在22 ： 00，而SRPP、REF和HRT2的表达高峰在第2天02 ： 00。在CATAS7-33-97中，5个基因在白天持续上调表达，最高峰出现在18 ： 00到22 ： 00之间，但表达低谷都在06 ： 00。在CATAS8-79中，5个基因表达在白天（06 ： 00至14 ： 00）都呈下调表达，但是表达低谷出现的时间点存在差异，其中HMGR1的表达低谷出现在22 ： 00，FDPS、SRPP和REF的表达低谷出现在10 ： 00，HRT2的表达低谷出现在14 ： 00（图3）。

2.4 同一基因在不同无性系间的表达分析

HMGR1在PR107、RRIM600、CATAS7-33-97和CATAS8-79中的表达高峰分别出现在14 ： 00、18 ： 00、14 ： 00和06 ： 00，其表达低谷分别出现在10 ： 00、10 ： 00、6 ： 00和22 ： 00。在CATAS8-79中，该基因在白天的表达呈下调趋势，而在其他3个无性系中，该基因在白天的表达呈上调趋势。FDPS表达的上下调趋势在PR107和CATAS8-79中相似，但是表达高峰出现的时间点不同。在PR107中，表达高峰出现在14 ： 00，而在CATAS8-79中，表达高峰出现在02 ： 00。FDPS在RRIM600和CATAS7-33-97中都是白天缓慢上调，表达高峰出现在22 ： 00。SRPP、REF和HRT2基因在PR107和CATAS7-33-97中的表达高峰出现在18 ： 00，而在RRIM600和CATAS8-79中的表达高峰出现在02 ： 00（图3）。

3 讨论与结论

本研究结果表明，相同基因在树干不同部位的表达量没有显著性差异，局部针刺对邻近部位的基因表达也没有明显影响，因此，不同时间点的胶乳样品可以采自同一植株树干的不同部位，可避免株间差异的干扰。

本文所选的5个橡胶生物合成关键酶基因表现出昼夜节律性表达，但是橡胶树无性系PR107和RRIM600之间的基因表达模式存在较大差异，每个基因表达高峰出现的时间点在这2个品系间都不相同。SRPP、REF和HRT2基因在无性系CATAS7-33-97中的表达模式与PR107相似，而REF、HRT2和SPRR基因在CATAS8-79中的表达模式相对倾向于RRIM600。由于这些材料都种植在同一环境中，所以基因表达的差异性和相似性主要取决于遗传因素。根据4个品系的遗传图谱（图4），无性系CATAS7-33-97的亲本是RRIM600和PR107[19]，而CATAS8-79分别与RRIM600和PR107有1/4的血缘[20]。

有研究结果表明 ：在拟兰芥中时间调控的核心时钟基因受到EARLY FLOWERING 3（AtELF3）的调控[21]；在一些组织中有数千个基因在时钟基因的调控下做规律性震荡[22]。因此，时钟基因的应答网络分为三个层次：核心时钟基因、上游生物钟调节器和下游时钟应答基因[23-24]。通过下游节律性表达基因找到上游核心时钟调控基因，继而发现时钟调节器，有助于研究生物的生理表现，改良生物的适应能力等[25]。虽然本研究所选择的橡胶生物合成关键酶基因不属于核心时钟基因，但是这些基因表达具有明显的节律性，而且这种节律性表达在不同无性系中都存在，表明其具有一定的代表性。从研究结果可推测这些基因可能处于钟基因应答网络的下游，而对于环境因素对基因表达的影响还有待进一步研究。

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