液相色谱—串联质谱法测定鸡肉中22种磺胺及其增效剂残留量

魏云计 朱臻怡 冯民 张科 王小晋 何健 魏斌 丁涛

摘 要：建立鸡肉中22种磺胺及其增效剂多残留检测的液相色谱-串联质谱法。样品经过甲酸-乙腈（1∶199，V/V）溶液提取，正己烷脱脂，液-液分配净化后，C18柱分离，甲醇、水-甲酸水溶液（体积分数0.1%）为流动相梯度洗脱，采用电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）正离子多反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）模式检测，外标法定量。结果表明：药物在2.0～100.0 μg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99，方法的检出限和定量限分别为0.5 μg/kg和2.0 μg/kg，在添加量为2.0、5.0、10.0 μg/kg时回收率为61.8%～88.3%，相对標准偏差小于11.3%。该方法简便快捷，可用于鸡肉中磺胺类药物及其增效剂的多残留检测。

关键词：液相色谱-串联质谱；鸡肉；磺胺；增效剂

Determination of Residues of 22 Sulfonamides and One Sulfonamide Potentiator in Chickens by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WEI Yunji1，ZHU Zhenyi1，FENG Min1，ZHANG Ke1， WANG Xiaojin1，HE Jian1，WEI Bin1，DING Tao2

（1.Huaian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huaian223001，China；2.Animal，Plant and Food Inspection Center（APFIC）， Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China）

Abstract： A multi-residue analytical method for the determination of 22 sulfonamides and 1 sulfonamide potentiator in chicken was developed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS）. The sample was extracted with formic acid-acetonitrile （1：199， V/V）， and the extract was defatted with n-hexane and cleaned up by liquid-liquid partition. The analytes were separated on a C18 column using a mobile phase consisting of methanol and water containing 0.1% （V/V） formic acid with gradient elution. The anaysis of the 23 analytes was performed by electrospray ionization （ESI） mass spectrometry under the positive mode using multiple reaction monitoring （MRM） and quantified by external standard method. The calibration curves showed good linearity. The limit of detection （LOD） and limit of quantitation （LOQ） were 0.5 and 2.0 μg/kg， respectively. At the spiked levels of 2.0， 5.0 and 10.0 μg/kg， recoveries ranged from 61.8% to 88.3%， with relative standard deviations （RSD） less than 11.3%. This method is convenient and suitable for the determination of residues of sulfonamides and the potentiator in chicken.

Keywords： liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS）； chicken； sulfonamides； potentiator

中图分类号：TS251.7文献标志码：A 文章编号：

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201508001

磺胺类药物是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，用于预防和治疗细菌感染性疾病，具有抗病原体范围广、化学性质稳定、使用方便、易于生产等特点，能抑制大多数革兰氏阳性菌和某些阴性菌，可单独使用，也常与抗菌增效剂甲氧苄氨嘧啶配伍，通过干扰细菌的二氢叶酸形成，影响细菌核蛋白合成而抑制细菌的生长繁殖。在畜牧业和兽医临床中，被广泛用于预防和治疗食源性动物疾病。磺胺类药物在体内的作用时间和代谢时间较长，长期使用可能导致在人体中蓄积，进而对人体机能产生危害[1-2]，破坏人的造血系统，造成溶血性贫血，并导致病原体产生抗药性。近年来，动物源食品中磺胺类药物残留量超标现象十分严重，尤其是在猪、禽、牛等动物源食品中。欧盟规定肉类食品中的磺胺类药物的最高残留限量（maximum residue limit，MRL）为单一磺胺类药物25.0 μg/kg，磺胺类药物总量100.0 μg/kg，甲氧苄氨嘧啶的最大残留限量50.0 μg/kg[3-5]。

目前用于检测磺胺类药物及其增效剂残留的方法有高效液相色谱法[6-11]、气相色谱法[12]、气-质联用法[13]、液-质联用法[14-20]、免疫测定法[21]等。液相色谱法、气相色谱法、气-质联用法、免疫测定法大多只能检测几种磺胺类药物，操作比较复杂，而且灵敏度低；液相色谱-串联质谱法具有较高的专属性和灵敏度，常用于药物的多残留分析，目前关于鸡肉中磺胺类药物检测的方法已有报道，但是测定的药物种类不多，连同磺胺增效剂同时测定的文献尚未有报道。本文经过不断的优化改进样品前处理提取方法与仪器方法，建立了鸡肉中22种磺胺和一种磺胺增效剂同时测定的分析方法。经过验证，该法具有快速、准确、检测限量较低，适用于鸡肉磺胺类药物及磺胺增效剂的残留量测定，满足日常检测工作的需要。

1 材料與方法

1.1 材料与试剂

鸡肉样品为市购。

23种药物标准品：磺胺胍（sulfaguanidine，SG）、磺胺二甲基异嘧啶（sulfisomidine，SMD）、磺胺醋酰（sulfacetamide，SA）、磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）、磺胺噻唑（sulfathazole，ST）、磺胺吡啶（sulfapyridine，SPD）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，SMR）、磺胺二甲基噁唑（sulfamoxol，SM）、磺胺二甲基嘧啶（sulfadimidine，SDMD）、磺胺对甲氧嘧啶（sulfameter，SMT）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，STZ）、磺胺甲氧哒嗪（sulfamethoxypyridazine，SMPD）、磺胺间甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺氯哒嗪（sulfachlorpyridazine，SCP）、磺胺邻二甲氧嘧啶（sulfadimoxine，SDX）、磺胺甲基异噁唑（sulfamethoxazole，SMZ）、磺胺氯吡嗪（sulfaclozine，SCZ）、磺胺二甲异噁唑（sulfisoxazole，SIZ）、磺胺苯酰（sulfabenzamide，SBZ）、磺胺间二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine，SDM）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline，SQX）、磺胺苯吡唑（sulfaphenazolum，SP）、甲氧苄氨嘧啶（trimethoprim，TMP），纯度均在98% 以上 德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、正己烷、甲酸均为色谱纯；水为超纯水；无水硫酸钠为分析纯。

1.2 仪器与设备

TSQ Quantum Ultra EMR串联质谱仪（配有电喷雾离子（ESI）源）、Surveyor液相色谱系统（包括Autosampler 1.3自动进样器）、MS Pump 2.0质谱泵 美国ThermoFisher公司；C18柱（150mm×3.1mm，3.5 ?m） 美国Agilent公司；C18固相萃取小柱（3mL/500mg） 美国Supelco公司；氮吹仪美国Organomation公司；超纯水器 美国Millipore公司；离心机 美国Sigma公司；超声波清洗仪宁波新芝生物科技公司；Oasis HLB固相萃取小柱（3 mL/60mg）、Oasis MCX固相萃取小柱（3 mL/60mg） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 标准储备液的配制

分别精密称取上述23种标准品适量，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L标准储备液，于冰箱中冷冻避光保存。

1.3.2 混合标准溶液的配制

分别准确吸取上述储备液各适量，置同一容量瓶中，用甲醇稀释制成含有上述23种物质各1.0 mg/L的混和标准溶液。

1.3.3 样品提取

准确称取（5.00±0.05）g样品于50 mL 离心管中，加入10 mL甲酸-乙腈（1：199，V/V）溶液，于涡旋混合器上混匀1 min，超声波提取10 min；加10 g无水硫酸钠，以8000 r/min的速率离心3 min，转移上层有机溶液至20 mL氮吹管中；再用10 mL甲酸-乙腈（1∶199，V/V）溶液重复提取残渣1次，合并2 次提取液于氮吹管中，于45 ℃水浴中氮吹至干，用1.0 mL甲醇-水（2∶8，V/V）溶解，加入1.0 mL正己烷溶液，涡旋混匀，于4 ℃、10000 r/min离心3 min，下层溶液经0.22 μm滤膜过滤至进样瓶中，供液相色谱-串联质谱仪分析。

1.3.4 仪器参数及测定条件

1.3.4.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）；进样量：25 μL；柱温：30 ℃；流动相：A为体积分数为0.1%甲酸-水溶液，B为甲醇；梯度洗脱条件：0～2 min，流动相A为90%；2.5～4.5 min，流动相A为30%；6.3～10.5 min，流动相A为70%；11～14 min，流动相A为10%；流速：250 μL/min。

1.3.4.2 质谱条件

采用电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）源；正离子方式扫描；喷雾电压：3000 V；离子源温度：400℃；鞘气：45bar，辅助气：10 bar；毛细管温度：350 ℃；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）方式检测；优化质谱条件见表1。

2结果与分析

2.1 提取溶解的选择

本实验在查阅大量参考文献[15-17，22]的基础上比较了乙腈、甲酸-乙腈（1∶199，V/V）、甲酸-乙腈（1∶99，V/V）、甲酸-乙腈（2∶98，V/V）和乙酸乙酯的提取效率。结果表明：上述几种溶剂对磺胺类药物及其增效剂均有较好的效果，使用乙酸乙酯提取时，会提取出较多的脂肪，后续的脱脂净化较难，影响色谱柱的使用寿命；乙腈和酸性乙腈都具有沉淀蛋白的效果，提取出的脂肪含量较低，有利于后续脱脂净化，由于磺胺类药物具有弱碱性，易溶于酸性溶液，采用甲酸-乙腈混合溶剂提取效率高于乙腈，同时实验对甲酸的用量进行优化，当随着甲酸浓度增加，大部分磺胺的回收率下降，因此采用甲酸-乙腈（1∶199，V/V）混合溶液作为提取溶剂。

2.2净化方法的比较

鸡肉样品中蛋白质和脂肪含量较高，提取过程中需要去除蛋白质、脂肪干扰物质，实验研究了液-液分配萃取净化结合冷冻高速离心脱脂除蛋白和固相萃取净化后的效果，同时结合磺胺类药物具有弱碱性的化学性质。本实验选取理论上适合其净化的C18、HLB和MCX小柱进行比较，结果表明：液-液分配萃取净化结合冷冻高速离心处理的方法回收率最高，HLB小柱净化效果优于C18和MCX小柱。样品经正己烷脱脂，高速冷冻离心后大部分脂肪和蛋白质被除去，固相萃取小柱对目标物可以净化和富集，但在操作过程中目标物会损失导致回收率降低，从实验周期、经济和环保方面考虑选取正己烷脱脂液-液分配净化。

2.3质谱条件的优化

磺胺类药物为弱碱性，结构式中具有仲氨基或叔氨基的化学电离性质，理论上选用ESI+作为离子化模式，在ESI+离子模式下容易得到H+形成较为稳定的[M+H]+准分子离子峰。实验采用注射泵直接进样的方式，将质量浓度为1μg/mL的每种标准物质，以5μL/min的流速分别注入离子源中在正离子模式下对每种物质进行一级质谱分析，得到每种分子离子峰，再对每种物质的准分子离子峰进行二级质谱分析，得到其相应的碎片离子信息，然后对每种物质的二级质谱进行碰撞能量、碰撞气、辅助气、喷雾电压、透镜补偿电压等参数优化，使每种物质的分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大时为最佳。

2.4 色谱条件的优化

实验同时测定的物质有23种，磺胺类药物存在多组同分异构体，特别是磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲氧哒嗪，3种物质性质极为相似很难将其分离。实验中比较了Thermo Hypersil GOLD柱（150 mm×2.1 mm，5 ?m），Thermo Hypersil GOLD柱（100 mm×2.1 mm，3 ?m），Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）和Agilent Polaris 5 C18-A柱（100 mm×2.0 mm，5 ?m）对正离子模式下23种物质的分离效果、响应强度和峰型。结果表明：23种物质在Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 ?m）上有最理想的分离效果、响应强度和峰型。磺胺类药物结构中含有氨基，水溶液中呈弱碱性，色谱峰易出现拖尾现象，当在流动相中加入一定量的甲酸，在酸性条件下促进磺胺类物质的电离，提高了离子化效率；同时甲酸有助于色谱柱内硅醇基的质子化，消除硅醇基与目标物之间的相互作用，减少色谱峰的拖尾，提高了分离效果。实验比较了在流动相中添加体积分数为0.02%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5%甲酸对目标物的响应和峰型的影响，结果表明：选用0.1%甲酸水溶液和甲醇作为流动相获得了最好的分离效果、响应强度和峰型。磺胺类化合物极性差异大和存在同分异构体现象，采用等度洗脱不容易将多组分磺胺分离，需要采用梯度洗脱进行分离。在梯度洗脱的开始阶段以10%甲醇作为流动相将极性较强的组分先洗脱出来，3 min后逐渐增加甲醇的比例，提高了同分异构体的分离度，使极性弱的组分逐一分离，实现了23种物质的有效分离。

2.5线性范围、检出限和定量限

为消除基质效应按照1.3.3节处理步骤提取阴性鸡肉样品，配制6个不同质量浓度的标准溶液，溶液中磺胺类及其增效剂质量浓度为2、5、10、20、50、100ng/mL；在本法所确定的色谱和质谱条件下进样测定，以标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，23种化合物的线性方程、相关系数如表1所示。

在空白鸡肉中添加混合标准品，以信噪比（S/N）≥3，确定方法的检出限为0.5 μg/kg；以信噪比≥10确定方法的定量限为2.0 μg/kg；鸡肉样品中添加2.0 μg/kg 23种混合标准物质的MRM色谱图见图1。

2.6方法的回收率和精密度

选取阴性鸡肉样品，添加23种磺胺及增效剂混合标准品，添加水平为2.0、5.0、10.0 μg/kg，每个添加5次平行，按上述优化的实验方法测定个组分的回收率和相对标准偏差，结果如表5所示。

3 结 论

实验建立了鸡肉中22种磺胺及其增效剂残留量同时测定的高效液相色谱-串联质谱法。样品经过甲酸-乙腈（1：199，V/V）溶液提取，正己烷脱脂，液-液分配净化，无需固相萃取净化，高效液相色谱-串联质谱测定。方法的定量限为2.0 μg/kg，空白鸡肉添加回收率为61.8%～88.3%，本方法检测周期短，灵敏度较高，回收率较好，满足实际检测工作的需要，適用于鸡肉中22种磺胺及其增效剂残留量的定性定量分析及确证。

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