α-硫辛酸对H9c2心肌细胞低氧及低氧／复氧损伤的保护作用及其机制探讨

操全霞，丁旵东

α-硫辛酸对H9c2心肌细胞低氧及低氧／复氧损伤的保护作用及其机制探讨

操全霞，丁旵东

目的探讨α-硫辛酸（α-LA）对H9c2心肌细胞低氧及低氧／复氧损伤的保护作用及其作用机制。方法研究包括H9c2心肌细胞低氧实验和低氧／复氧实验两部分，分成常氧组、低氧组或低氧／复氧组、LA组、乙醛脱氢酶抑制剂异黄酮苷（Daidzin）组（Daidzin组）、二甲亚砜（DMSO）溶剂对照组（DMSO组）。采用噻唑蓝（MTT）比色法检测心肌细胞存活率；微量酶标法测定乳酸脱氢酶（LDH）活性；ELISA法检测心肌细胞乙醛脱氢酶2（ALDH2）活性；硫代苯巴比妥酸法检测丙二醛（MDA）水平。结果与常氧组比较，低氧组及低氧／复氧组细胞存活率均下降（P＜0.01），LDH活性及MDA含量均升高（P＜0.01）；与低氧组或低氧／复氧组比较，LA组细胞存活率上升（P＜0.01）、ALDH2活性增加（P＜0.05）、LDH活性及MDA含量降低（P＜0.01）；LA组、Daidzin组、DMSO组3组比较，LA组与DMSO组间存活率、ALDH2、LDH、MDA比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；Daidzin组与LA组、DMSO组比较，细胞存活率及ALDH2活性降低（P＜0.05），LDH活性及MDA含量升高（P＜0.05），差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论α-LA可通过上调ALDH2活性并减少过氧化终产物形成，最终减轻心肌细胞低氧及低氧／复氧过程中的氧化损伤。

α-硫辛酸；异黄酮苷；乙醛脱氢酶；心肌细胞；低氧；低氧／复氧

随着生活水平的提高，冠心病日渐成为威胁人类生命健康的主要疾病。冠状动脉粥样硬化引起血管管腔狭窄或阻塞是冠心病发生发展的主要机制，经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）或冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass graft，CABG）开通严重病变的冠状动脉，进行血运重建，极大地缓解了冠心病心肌缺血症状及预后。但不适用于PCI或CABG手术的冠状动脉分支病变所致的心肌缺血，以及“罪犯”血管开通后导致的缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）［1］，仍然是困扰临床工作者的现实问题，如何进一步减少心肌缺血或IRI是目前临床研究关注的热点。研究［2－5］表明，自由基损伤在缺血及IRI的发病机制中起着关键性作用。Trevisan et al［6］研究心血管病危险因素时发现，心血管危险因子数量与氧化应激状态及抗氧化能力降低呈显著相关性。研究［7－8］显示，乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）能降低大鼠心肌低氧损伤引起的细胞凋亡及心肌IRI时氧化应激水平，改善其心脏功能，而且对氧化应激导致的神经细胞、内皮细胞损伤有拮抗作用。α-硫辛酸（alpha-lipoic acid，α-LA）作为ALDH2的激活剂及较强的抗氧化剂，是否对心肌缺血或IRI起到保护作用尚不清楚。该实验通过H9c2心肌细胞低氧和低氧／复氧模型，研究α-LA是否对H9c2心肌细胞低氧或低氧／复氧损伤起到保护作用并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞株H9c2大鼠心肌细胞株购自上海生命科学研究院细胞库。

1.2 主要试剂和仪器α-LA（山西亚宝药业集团股份有限公司）；异黄酮苷（Daidzin）（上海源叶生物科技有限公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM合成培养基（美国Hyclone公司）；噻唑蓝（MTT）（美国Sigma公司）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒及丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；ALDH2试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（杭州碧云天生物技术有限公司）；其余试剂为国产分析纯级；CO2培养箱（美国Thermo公司）；低氧小室（美国billups rothenberg inc公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）。Daidzin溶于二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。

1.3 低氧及低氧／复氧损伤模型的建立［9］低氧模型建立：H9c2心肌细胞正常培养24 h达60%～70%融合后，换成不含血清的高糖DMEM培养基培养并置于充满95%N2、5%CO2的低氧小室内37℃培养24 h。低氧／复氧模型建立：H9c2心肌细胞正常培养24 h达60%～70%后，换成不含血清的高糖DMEM培养基培养并置于充满95%N2、5%CO2的低氧小室内37℃培养24 h后，置于37℃、5% CO2的普通培养箱复氧12 h。

1.4 实验步骤

1.4.1 H9c2心肌细胞的培养 H9c2细胞株在含10%胎牛血清高糖DMEM完全培养基中培养（条件为37℃、5%CO2），2～3 d传代1次，实验时取对数生长期细胞。

1.4.2 实验分组及设计 低氧模型分组：常氧组（正常培养24 h后换液，不做任何处理继续培养24 h）；低氧组（正常培养24 h后换成不含血清的高糖DMEM培养基培养并置于充满95%N2、5%CO2的低氧小室内培养24 h）；LA组（正常培养24 h后换成不含血清的高糖DMEM培养基培养及1×10－4mol／L［9］的α-LA，置于充满95%N2、5%CO2的低氧小室内培养24 h）；Daidzin组（正常培养24 h后换成不含血清的高糖DMEM培养基培养、1×10－4mol／L的α-LA及60 μmol／L Daidzin［10］，置于充满95%N2、5%CO2的低氧小室内培养24 h）；DMSO组（正常培养24 h后换成不含血清的高糖DMEM培养基培养、1×10－4mol／L的α-LA及DMSO，置于充满95%N2、5%CO2的低氧小室内培养24 h）。

低氧／复氧模型分组：常氧组（正常培养24 h后换液，继续培养36 h，不做任何处理）；低氧／复氧组（正常培养24 h后，换成不含血清的高糖DMEM培养基培养并置于充满95%N2、5%CO2的低氧小室内培养24 h，置于37℃、5%CO2的普通培养箱复氧12 h）；LA组（正常培养24 h后，换成不含血清的高糖DMEM培养基培养及1×10－4mol／L的α-LA，置于充满95%N2、5%CO2的低氧小室内培养24 h后，置于37℃、5%CO2的普通培养箱复氧12 h）；Daidzin组（正常培养24 h后，换成不含血清的高糖DMEM培养基培养、1×10－4mol／L的α-LA及60 μmol／L Daidzin，置于充满95%N2、5%CO2的低氧小室内培养24 h后，置于37℃、5%CO2的普通培养箱复氧12 h）；DMSO组（正常培养24 h后，换成不含血清的高糖DMEM培养基培养、1×10－4mol／L 的α-LA及DMSO，置于充满95%N2、5%CO2的低氧小室内培养24 h后，置于37℃、5%CO2的普通培养箱复氧12 h）。

1.5 H9c2心肌细胞存活率测定采用MTT［11］比色法检测（设不加细胞只加孵育液为空白组）。培养96孔板中的H9c2心肌细胞，接种密度为8 500个／孔，各组进行相应处理后，每孔加入MTT溶液（5 mg／ml）10 μl，37℃孵育4 h后移弃培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度（absorbance，A）值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝（A试验组／A对照组）×100%。

1.6 LDH活性检测各组进行相应处理后，吸取细胞培养上清液，按照试剂盒说明书进行检测。

1.7 MDA含量检测各组进行相应处理后，吸取细胞裂解上清液，采用硫代巴比妥酸法测定MDA，按照试剂盒说明进行检测。

1.8 ALDH2活性检测各组进行相应处理后，吸取细胞裂解上清液，采用ELISA法测定ALDH2活性，按照试剂盒说明书进行检测。

1.9 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行分析，所有资料呈正态分布，所有实验重复6次，数据以¯x ±s表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验。

2 结果

2.1 α-LA对心肌细胞存活率的影响

2.1.1 低氧模型 低氧组与常氧组比较心肌细胞存活率显著下降（P＜0.01），LA组与低氧组比较心肌细胞存活率显著上升（P＜0.01），表明α-LA能显著改善心肌细胞活力。LA组、Daidzin组、DMSO组3组比较差异有统计学意义（F＝14.514，P＜0.01）；两两比较显示，Daidzin组与LA组、Daidzin组与DMSO组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），LA组与DMSO组比较差异无统计学意义（P ＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA改善细胞活力的作用，DMSO对α-LA的作用无影响，见表1。

2.1.2 低氧／复氧模型 低氧／复氧组与常氧组比较心肌细胞存活率显著下降（P＜0.01），LA组与低氧／复氧组比较心肌细胞存活率显著上升（P＜0.01），表明α-LA能显著改善心肌细胞活力。LA组、Daidzin组、DMSO组3组比较差异有统计学意义（F＝5.271，P＜0.05）；两两比较显示，Daidzin组与LA组、Daidzin组与DMSO组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），LA组与DMSO组比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA改善细胞活力的作用，DMSO对α-LA的作用无影响，见表2。

2.2 α-LA对心肌细胞LDH的影响

2.2.1 低氧模型 低氧组与常氧组比较心肌细胞培养上清的LDH活力升高（P＜0.01），LA组与低氧组比较心肌细胞培养上清的LDH活力显著降低（P＜0.01），表明α-LA能显著降低低氧组的LDH释放率。LA组、Daidzin组、DMSO组3组比较差异有统计学意义（F＝18.674，P＜0.01）；两两比较显示Daidzin组与LA组、Daidzin组与DMSO组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），LA组与DMSO组比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA减少LDH释放的作用，DMSO对α-LA的作用无影响，见表1。

2.2.2 低氧／复氧模型 低氧／复氧组与常氧组比较心肌细胞培养上清的LDH活力升高（P＜0.01），LA组与低氧／复氧组比较心肌细胞培养上清的LDH活力显著降低（P＜0.01），表明α-LA能显著降低低氧／复氧组的LDH释放率。LA组、Daidzin组、DMSO组3组比较差异有统计学意义（F＝17.684，P＜0.01）；两两比较显示，Daidzin组与LA组、Daidzin组与DMSO组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），LA组与DMSO组比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA减少LDH释放的作用，DMSO对α-LA的作用无影响，见表2。

2.3 α-LA对心肌细胞MDA的影响

2.3.1 低氧模型 低氧组与常氧组比较心肌细胞的MDA含量升高（P＜0.01），LA组与低氧组比较心肌细胞的MDA含量显著降低（P＜0.01），表明α-LA能显著降低低氧组的MDA含量。LA组、Daidzin组、DMSO组3组比较差异有统计学意义（F＝7.757，P＜0.05）；两两比较显示，Daidzin组与LA组、Daidzin组与DMSO组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），LA组与DMSO组比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA减少MDA含量的作用，DMSO对α-LA的作用无影响，见表1。

2.3.2 低氧／复氧模型 低氧／复氧组与常氧组比较MDA含量升高（P＜0.01），LA组与低氧／复氧组比较心肌细胞的MDA含量显著降低（P＜0.01），表明α-LA能显著降低低氧／复氧组的MDA含量。LA组、Daidzin组、DMSO组3组比较比较差异有统计学意义（F＝23.124，P＜0.01）；两两比较显示，Daidzin组与LA组、Daidzin组与DMSO组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），LA组与DMSO组比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA减少MDA含量的作用，DMSO对α-LA的作用无影响，见表2。

2.4 α-LA对心肌细胞ALDH2的影响

2.4.1 低氧模型 低氧组与常氧组比较ALDH2含量无显著差异（P＞0.05），LA组与低氧组比较ALDH2含量上升（P＜0.05），表明α-LA能显著增加心肌细胞ALDH2的含量。LA组、Daidzin组、DMSO组3组比较比较差异有统计学意义（F＝16.376，P ＜0.01）；两两比较显示，Daidzin组与LA组、Daidzin组与DMSO组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），LA组与DMSO组比较差异无统计学意义（P ＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA增加ALDH2含量的作用，DMSO对α-LA的作用无影响，见表1。

2.4.2 低氧／复氧模型 常氧组与低氧／复氧组比较心肌细胞的ALDH2含量无显著差异（P＞0.05），LA组与低氧／复氧组比较ALDH2含量上升（P＜0.05），表明α-LA能显著增加心肌细胞ALDH2的含量。LA组、Daidzin组、DMSO组3组比较差异有统计学意义（F＝9.231，P＜0.05）；两两比较显示，Daidzin组与LA组、Daidzin组与DMSO组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），LA组与DMSO组比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明Daidzin具有抑制α-LA增加ALDH2含量的作用，DMSO对α-LA的作用无影响，见表2。

表1 α-LA对低氧损伤后H9c2心肌细胞的影响（n＝6，±s）

表1 α-LA对低氧损伤后H9c2心肌细胞的影响（n＝6，±s）

与低氧组比较：*P＜0.05；与LA组比较：＃P＜0.05

项目常氧组低氧组LA组Daidzin组DMSO组心肌细胞存活率（%）100.00±00.00*66.73±2.0683.75±2.48*74.53±3.64＃79.01±5.89 LDH活性（U／L）101.12±21.62*221.78±29.67148.04±29.35*230.78±29.41＃154.04±18.38心肌细胞MDA含量（nmol／ml）0.555±0.054*1.265±0.0760.766±0.097*1.121±0.146＃0.824±0.107心肌细胞ALDH2含量（ng／ml）0.300±0.0670.229±0.0540.394±0.014*0.305±0.043＃0.390±0.125

表2 α-LA对低氧／复氧损伤后H9c2心肌细胞的影响（n＝6，±s）

表2 α-LA对低氧／复氧损伤后H9c2心肌细胞的影响（n＝6，±s）

与低氧／复氧组比较：*P＜0.05；与LA组比较：＃P＜0.05

项目常氧组低氧／复氧组LA组Daidzin组DMSO组心肌细胞存活率（%）100.00±00.00*51.75±6.7966.59±5.75*54.91±8.61＃65.04±4.82 LDH活性（U／L）131.14±21.40*261.66±30.11199.28±21.49*274.52±25.72＃206.57±24.7心肌细胞MDA含量（nmol／ml）0.637±0.058*1.629±0.0621.046±0.069*1.477±0.106＃1.141±0.063心肌细胞ALDH2含量（ng／ml）0.317±0.1240.303±0.0380.400±0.039*0.283±0.047＃0.383±0.011

3 讨论

冠心病的发生与冠状动脉粥样硬化的程度有密切关系，药物治疗可延缓或阻止冠状动脉粥样硬化病变的发展，改善心肌供血，减少心绞痛的发作及心肌梗死的发生，但对于冠状动脉严重狭窄甚至闭塞病变，PCI或CABG在血运重建方面则起着更为重要的作用，当然可能由此导致的心肌IRI仍然备受关注。心肌IRI是指心肌血供中断一段时间后又突然恢复了血供，原缺血心肌发生了较血供恢复前更严重的损伤［12］，心肌再灌注时产生的大量氧自由基是导致心肌再灌注损伤的主要因素［13］。MDA作为脂质过氧化的代谢产物其含量可以反映细胞受氧自由基攻击的严重程度，LDH的活性也是评价心肌细胞低氧及低氧复氧损伤程度的重要指标，MTT是一种可以进入活细胞的染料，吸光度值反映出心肌细胞内线粒体脱氢酶的活性，同时还间接反映心肌细胞的存活情况。本实验低氧组及低氧／复氧组与常氧组比较，心肌细胞存活率降低，培养液中LDH活性升高，心肌细胞MDA含量升高，表明本实验中心肌细胞低氧损伤模型和低氧／复氧模型建立是成功的，为分析ALDH2激活剂α-LA的保护作用和ALDH2特异性抑制剂Daidzin的干预作用提供了可靠的基础。

α-LA作为ALDH2的激活剂，同时也是一种较强的抗氧化剂，能否在抗低氧或低氧／复氧损伤方面发挥重要作用值得进一步探讨。本研究显示，与低氧组或低氧／复氧组比较，α-LA能使低氧或低氧／复氧心肌细胞的ALDH2活性显著增加，LDH、MDA含量显著下降，从而显著提高了低氧或低氧／复氧条件下的细胞存活率，加入ALDH2特异性抑制剂Daidzin后可显著抑制α-LA的这一作用，差异均有统计学意义。为排除Daidzin的溶媒DMSO对实验结果的影响，增设DMSO组对照，显示DMSO组数据与LA组比较差异无统计学意义，说明加入Daidzin后对α-LA保护作用的抑制系Daidzin对ALDH2特异性抑制所致。

综上所述，α-LA可以通过上调ALDH2的活性、减少过氧化终产物的形成，实现减轻心肌细胞低氧损伤和低氧／复氧损伤的目的，为临床应用α-LA治疗冠心病缺血损伤和再灌注损伤提供理论依据。

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The protective effects of alpha-lipoic on H9c2 cardiomyocytes undergoing hypoxia or hypoxia／reoxygenation（H／R）injury and its possible mechanism

Cao Quanxia，Ding Chandong
（Dept of Internal Medicine，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo investigate the protective effects of alpha-lipoic（α-LA）on H9c2 cardiomyocytes undergoing hypoxia or hypoxia／reoxygenation（H／R）injury and explore its possible mechanisms.MethodsH9c2 cardiomyocytes in hypoxia or H／R injury researches were respectively divided into normal control group，hypoxia or H／R group，hypoxia or H／R＋α-LA group（LA group），hypoxia or H／R＋α-LA＋Daidzin group（Daidzin group）and hypoxia or H／R＋α-LA＋DMSO group（DMSO group）.The myocardial cell survival was detected by MTT，the activity of LDH and ALDH2 were respectively analyzed by microtitration and ELISA，the MDA level was measured by TBA.ResultsCompared to the normal control group，the cell survival rates of hypoxia and H／R group were decreased（P＜0.01），the levels of MDA and LDH were significantly increased（P＜0.01）.Compared to the hypoxia or H／R group，the cell survival rates and ALDH2 activities of LA group were improved（P＜0.05），the levels of MDA and LDH were decreased（P＜0.01）.Compared to the LA group and DMSO group，the cell survival rates and ALDH2 activities of Daidzin group were decreased（P＜0.05），the levels of MDA and LDH were increased（P＜0.05），and no significant differences of all the above measures were found between LA group and DMSO group（P＞0.05）.Conclusionα-LA can protect H9c2 cardiomyocytes from hypoxia or H／R injury by means of upregulating activities of ALDH2 and decreasing hypoxia or H／R induced lipid peroxidation.

alpha-lipoic acid；Daidzin；ALDH2；cardiomyocyte；hypoxia；hypoxia／reoxygenation

R 541.4

A

1000－1492（2015）07－1024－05

2015－03－17接收

安徽省卫生厅医学科研课题计划（编号：2010C058）

安徽医科大学第二附属医院综合内科，合肥 230601

操全霞，女，硕士研究生；丁旵东，男，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：dcdsunshine＠sina.com