不同毛色贵州水牛MC1R、TYR基因SNP研究

敖啟燕，胡玲玲，罗师红，赵永超，王 振，刘若余

(贵州大学动物科学学院/贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

不同毛色贵州水牛MC1R、TYR基因SNP研究

敖啟燕，胡玲玲，罗师红，赵永超，王 振，刘若余

(贵州大学动物科学学院/贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

[目的]为促进贵州白水牛资源保护与开发的科学性，同时为品种选育提供更加充分的科学依据。[方法]本实验以贵州水牛(灰色)为对照组，以贵州白水牛为实验组分别构建DNA池，对不同毛色贵州水牛的MC1R基因和TYR基因进行PCR扩增并确定SNP位点，并利用生物信息学软件分析突变位点对RNA的二级结构，蛋白质的二、三级结构的影响。[结果]在贵州水牛(灰色)和贵州白水牛扩增的MC1R基因中共同筛选到错义突变exon1-T843C，导致缬氨酸(Val)变成丙氨酸(Ala)，还在贵州水牛(灰色)中筛选到exon1-C1228T(同义)、exon1-G1330A两个突变位点。在两种水牛扩增的TYR基因共同筛选到2个错义突变exon1-G826A、exon5-T70C，分别导精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His)、亮氨酸(Leu)突变为异亮氨酸(Ile)；1个同义突变exon3-A83G。

贵州水牛;MC1R基因;TYR基因;SNPs

1 前言

水牛(Bubalus babulis)主要分布在亚洲地区，是热带、亚热带地区独具特色的一个物种[1]。根据亚洲水牛的外形、用途和生活习性将其分为河流型(B.bubalus arnee)水牛和沼泽型(B.bubalus carabanesis)水牛两种水牛类型[2]。《贵州省畜禽品种志》中记载到贵州的水牛归属为沼泽型水牛，毛色大多数为灰色，占总数的73.19%，少部分为白色，占总数的5.7%[3]。罗在仁等通过统计研究表明，沼泽型水牛白色和灰色交配的F1代全部为白色，而F2代中白色和灰色的比例约为3∶1，白色对灰色完全显性，灰色为隐性纯合[4]。贵州白水牛主要分布在遵义市凤冈县，因毛色具有十分明显的白色而出名，是贵州少有的品种。贵州白水牛肉用性能较好，潜力较大[5]。

哺乳动物的毛发颜色主要是由黑色素的数量、性质与分布决定的[6]。黑色素根据性质不同可分为2种类型：一种是褐黑色素，另一种是真黑色素[7]。哺乳动物黑色素合成的调控系统复杂，在黑素细胞的每一个发育水平都有不同的基因调控。黑色素皮质素受体 1(melanocortin receptor1,MC1R)基因是一种调节黑素细胞合成褐黑色素与真黑色素的关键受体, 现有的资料证实MC1R对很多物种的色素沉着发挥着重要的调节作用。MC1R基因是由Extension基因座编码的，并在黑色素细胞中得到表达[6]。

Marklund L研究表明牛的MC1R基因位于第18号染色体，长954 bp[8]。Shinyi等用 PCR- RFLP分析了日本黑牛、褐色牛和朝鲜牛M C1R基因型的频率，结果显示朝鲜牛的e/e 基因型频率远大于褐色牛的e/e基因型频率，但是这两种牛的毛色却十分的接近。所以他们推测牛毛色的红色和褐色还有其他的基因决定。甘海云等对中国荷斯坦黑白花牛、中国荷斯坦红白花牛、鲁西黄牛与渤海黑牛的MC1R基因做了生物信息学分析，在所检测的品种牛MC1R基因内筛选到一个新的SNP位点，此位点对毛色遗传的影响需要进一步研究[9]。苗永旺等采用 DNA 序列分析技术对水牛MC1R基因多态性进行了检测，并且分析了其是否与毛色性状遗传相关联，结果显示白色和灰色沼泽型水牛的基因型皆为EBS/EBS，这表明 MC1R 基因与水牛的白色和灰色毛色性状可能无关[10]。

酪氨酸酶(TYR)基因在黑色素的生物合成的调控中有着不可替代的作用，酪氨酸酶为黑色素合成的限速酶，具有多巴氧化酶和酪氨酸羟化酶活性，它的活性强弱决定黑色素的合成，高活性导致产生真黑色素[11]。研究发现通常是在受到短波(紫外光)刺激时，TYR活跃性能增加会导致黑色素合成加快。刑思远以水貂为研究对象，对水貂TYR基因进行生物学分析，结果表明TYR基因变异和水貂毛色呈现显著相关，因此TYR基因可作为研究水貂毛色的候选基因[12]。孟浩浩通过PCR-SSCP 和测序技术检测毛色不同的中国美利奴羊(军垦型)、阿勒泰羊TYR基因多态性，结果表明TYR基因 5'-UTR处G→C转换(g.683bp)和阿勒泰羊毛色极显著相关(\%P\%<0.01)，可将TYR基因作为阿勒泰羊毛色相关的标记基因[13]。Schmidtz等选择加拿大肉牛作为连锁定位的参考家系，将牛TYR基因定位29号染色体上[14]。牛TYR基因一直被认为是决定毛色的位点之一，但是国内外对于牛科动物特别是水牛的TYR基因对毛色影响的研究相对较少。

本实验以不同毛色贵州水牛为研究对象，采用PCR技术检测贵州水牛MC1R和TYR基因序列多态性，以分析贵州水牛毛色遗传的分子机制，从而为贵州水牛的保种选育及利用提供科学依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料

本实验在各品种饲养管理条件基本相同的情况下采用成年健康无病的水牛为实验样本。贵州水牛(灰色)的耳部肌肉组织30头采自贵州省遵义市凤岗县农户，贵州白水牛的血样15头采用随机抽样方法从贵州省遵义市凤岗县石径乡白水牛保种场采集白水牛血样。

2.2 实验方法

2.2.1 提取DNA和构建DNA池 分别采用柱式基因组DNA抽提试剂盒(血液)、磁珠法动物组织基因组DNA抽提试剂盒提取贵州白水牛的血液、贵州水牛(灰色)的耳部肌肉组织DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取效果，使用紫外分光光度计来测定DNA样品浓度。将贵州水牛(灰色)及贵州白水牛DNA样品的浓度分别调整至100 ng/μL，从15头贵州白水牛的血液DNA中各取5 μL混合在一起构建贵州白水牛的DNA池，同时也从贵州水牛(灰色)的耳部肌肉组织DNA中各取5 μL混合在一起构建贵州水牛(灰色)的DNA池。

2.2.2 引物的设计及 DNA的扩增 在NCBI数据库中找到水牛MC1R基因DNA序列(GenBank登录号：AC_000175.1)，利用Primer-BLAST 5.0软件设计2对特异性引物。详见表1。

在从NCBI数据库中找到水牛TYR基因座编码基因DNA序列(GenBank登录号：AC_000186.1)，利用NCBI在线软件Primer-BLAST设计5对特异性引物。详见表2。

表1 引物序列、退火温度及目的片段长度

表2 引物序列、退火温度及目的片段长度

以贵州水牛(灰色)和贵州白水牛分别构建的DNA池作为DNA模板进行特定部分PCR扩增。PCR扩增采用鼎国生物公司生产的Mix，反应体系总体积为20 μL，各对引物最适退火温度见表1，2。利用1%琼脂糖凝胶电泳来检测PCR产物，凝胶成像仪来观察电泳的结果。

2.2.3 序列测序与分析 PCR扩增产物送交上海英骏生物技术有限公司纯化后进行双向测序。利用DNAstar软件对测序结果进行校正比对，结合BLAST分析确定SNPs位点。

2.2.4 测量序列测序图峰高和估算等位基因频率 利用DNAStar软件中的SeqMan软件查看测序结果，并利用MWSnap软件中的直尺测量测序结果图上各多态位点等位基因相对应的峰高高度。利用下列公式来估算各多态位点等位基因频率。$$Ay=By/(Ba+Bb),y=a,b$$ 公式中的Ay表示在多态性位点上某等位基因频率，Ba和Bb分别表示测序结果图上该多态性位点等位基因a和b的峰高高度。

2.2.5 MC1R基因和TYR基因的RNA二级结构预测与蛋白结构分析

(1)RNA二级结构的在线分析软件：

(http://www.genebee.msu/services/rna2_reduced.html)

(2)蛋白质二级结构的在线分析软件：

(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_server.html)

(3)蛋白质三级结构的在线分析软件：

(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)

3 结果与分析

3.1 PCR产物及测序结果

本试验以贵州水牛(灰色)和贵州白水牛为研究对象，以MC1R基因为目的基因，设计2对特异性引物扩增水牛MC1R基因目的序列，以TYR基因为目的基因，设计5对特异性引物扩增水牛TYR基因目的序列。利用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，扩增结果详见图1和图2。

图1 贵州水牛(灰色)和贵州白水牛MC1R基因第1外显子扩增产物检测结果

图2 贵州水牛(灰色)和贵州白水牛TYR基因第1外显子扩增产物检测结果

将两个基因的PCR扩增产物送交上海英骏生物技术有限公司纯化后进行双向测序，测序得到的结果与从NCBI数据库中获得的水牛MC1R基因DNA序列(GenBank登录号：AC_000175.1)基本上符合，所以可以确定实验中经过测序得到的结果即为水牛MC1R基因序列。通过利用BLAST软件进行测序结果分析共发现贵州水牛(灰色)有4个多态性位点，贵州白水牛有2个多态性位点，以MC1R基因第1外显子第1位碱基计数为1，贵州水牛(灰色)的SNPs位点分别为：exon1-G617A、exon1-T843C、exon1-C1228T、exon1-G1330A，贵州白水牛的SNPs位点分别为：exon1-G617A、exon1-T843C，详见图3。同时将测序结果与贵州水牛(灰色)TYR基因DNA序列进行对比(GenBank登录号：AC_000186.1)DNA序列基本吻合，可以确定为贵州白水牛TYR基因序列。BLAST分析共发现4个SNPs，以TYR基因每1外显子第1位碱基计数为1，SNPs位点分别为： exon1-G826A、exon3-A83G、exon5-T70C和exon4-C170A，详见图4。这些多态性位点可能在不同水牛品种中普遍存在，所以还需要扩大不同品种不同毛色的水牛个体数更进一步的研究。同时MC1R基因和TYR基因的多态性位点是否造成水牛的毛色个体差异也需要进一步的深入研究。

图3 贵州水牛(灰色)、白水牛MC1R基因DNA池的PCR产物检测及BLAST分析结果

图4 贵州水牛(灰色)、白水牛TYR基因DNA池的PCR产物测及BLAST分析结果

3.2 估算SNPs等位基因频率

利用MWSnap软件中的标尺测量贵州白水牛MC1R基因和TYR基因各SNP等位基因相对应的峰高高度并根据公式估算各SNPs等位基因频率。MC1R基因各SNP等位基因频率详见表3。TYR基因各SNP等位基因频率详见表4。由表3和表4都可看出，同一突变位点，不同毛色贵州水牛突变频率差异较大。

3.3 分析MC1R基因和TYR基因的RNA二级结构

根据MC1R基因和TYR基因各SNP位点突变前与突变后基因RNA二级结构的预测结果可以看出，两个基因多态性位点均会造成各自基因RNA二级结构的最小自由能发生改变。详见表5和表6。

表3 MC1R基因SNPs等位基因频率估算结果

表4 TYR基因SNPs等位基因频率估算结果

表5 MC1R基因SNP位点突变前后RNA二级结构最小自由能

表6 TYR基因SNP位点突变前后RNA二级结构最小自由能

根据最小自由能原理MC1R基因和TYR基因的RNA二级结构最小自由能发生变化的同时可能会影响到RNA二级结构的稳定性，同时还有可能会影响到后续蛋白质的翻译过程以及后续蛋白质的相关功能。

3.4 分析突变前后MC1R和TYR的蛋白二级与三级结构

利用在线软件预测贵州水牛(灰色)和贵州白水牛MC1R基因及TYR基因突变前后蛋白质二级结构的变化，详见表7，8。

表7 突变前后MC1R蛋白二级结构分析结果

表8 突变前后TYR蛋白二级结构分析结果

通过在线软件对MC1R基因和TYR基因蛋白质三维结构进行预测和突变分析，能够帮助我们更好的理解MC1R基因和TYR基因蛋白质的结构与功能。通过对实验结果的分析可以看出多态性位点(SNP)会造成蛋白质三维结构发生变化，可能会影响蛋白质的功能。

4 讨论与结论

目前MC1R基因是一个针对控制动物毛色的主要研究范围,根据不同的原因,人们普遍认为牛的毛色是判定牛品种的重要标志，认为牛的毛色与乳和肉等方面的生产性能有着直接的关系，很多人都非常重视牛的毛色。结合国内和国外已有的研究显示，MClR基因是调控牛毛色的最主要基因,牛的毛色之所以存在差异，是因为它们拥有不同的MClR基因型。在很早的时候就发现牛MCIR基因有ED，E+，e三种基因型，Francois等在2000年通过竞争引物-PCR(COP-PCR)方法检测到牛MC1R的基因型除了有ED,E+,e三种基因型之外，还有一种基因型E1[15]。

在黑色素生成过程中酪氨酸酶(TYR)是形成的关键酶，黑色素生成的速度和产量也是取决与其表达量和活性。黑色素是多巴醌、吲哚-5，6醌和多巴色素的聚合物，然而酪氨酸酶正是把酪氨酸转化成多巴的中介，多巴又被氧化成多巴醌，有进一步转变为各种衍生物组合构成黑色素。由于酪氨酸酶在毛色性状上的重要性，编码酪氨酸酶的TYR基因也被列为黑色素性状和毛色形成的重要研究基因之一。

本试验在贵州水牛(灰色)和贵州白水牛扩增的MC1R基因中共同筛选到错义突变exon1-T843C，导致缬氨酸(Val)变成丙氨酸(Ala)，还在贵州水牛(灰色)中筛选到exon1-C1228T(同义)、exon1-G1330A两个突变位点。在两种水牛扩增的TYR基因共同筛选到2个错义突变exon1-G826A、exon5-T70C，分别导精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His)、亮氨酸(Leu)突变为异亮氨酸(Ile)；1个同义突变exon3-A83G。分别比较MC1R基因和TYR基因的多态性位点等位基因频率，均发现不同突变位点突变频率存在显著差异，这一发现是否在其他白水牛中也有所不同，需要加大水牛的品种及数量进行实验分析；突变前后MC1R基因和TYR基因RNA二级结构均发生改变，并影响到蛋白质二级、三级结构。下一步工作会增大研究水牛数量，并分析MC1R基因和TYR基因不同位点与贵州白水牛毛色上的遗传多样性，探究MC1R基因和TYR基因对白水牛毛色的相关性，从而为贵州特有品种白水牛来源以及整个水牛品种毛色遗传多样性的研究奠定基础，同时为白水牛的选育工作提供科学的理论依据。

[1] 章纯照. 中国水牛科学[M]. 南宁: 广西科技出版社, 2000:120-155.

[2] 黄右军, 刘业基. 广西本地水牛与么拉水牛染色体组型的差异[J]. 畜牧兽医报, 1998,19(4): 231-236.

[3] 陈永泽. 贵州省畜禽品种志[M]. 贵阳:贵州科技出版社, 1993:20-25.

[4] 罗在仁, 许艳芬, 尹以昌, 等. 水牛的毛色遗传规律研究[J]. 中国牛业科学, 2012,38(1): 14-17.

[5] 陈沙江. 贵州凤岗白水牛[J].贵州畜牧兽医,1996,20(5):8.

[6] 白春雨, 高玉花, 庞全海. 影响动物毛色的基因[J]. 国外畜牧学, 2008,28(5):71-73.

[7] 蒋琼. 家畜的毛色遗传探究[J]. 安徽农业, 2004,23(05): 30-34.

[8] Marklund L, Moiler M J, Sandberg K, et a1. A missense mutationin the gene for melanocyte-stimulating hormone receptor(MC1R) is associated with the chestnut coat color in horses [J]. Mamm Genome. 1996,7(12): 895-899.

[9] 甘海云, 李建斌, 仲跻峰, 等. 牛毛色基因的研究进展[J]. 中国草食动物, 2007,(1):23-25.

[10] 苗永旺, 吴桂生, 王磊, 等. 黑色素皮质素受体1基因对水牛毛色遗传的影响[J]. 中国科学 C 辑: 生命科学, 2009,39(12): 1155-1161.

[11] 邓学梅. 用于鸡基因定位的资源群体的建立和黑色素等质量性状的遗传分析[D].北京：中国农业大学, 2001.

[12] 刑思远. 水貂TYR基因单核苷酸多态性与毛色的相关研究[D].北京：中国农业科学院, 2014.

[13] 孟浩浩. TYR、ASIP 基因多态性与绵羊毛色相关的研究[D].石河子：石河子大学, 2014.

[14] Schmidtz B H, Buchanan, Plante F C, et al. Linkage mapping of the Tyrosinase gene to bovine chromosome 29 [ J]. Animal Genetics, 2001, 32(2): 119-120.

[15] 徐敏. 牛黑素皮质激素受体1(MC1R)基因单核苷酸多态位点(SNP)与毛色表型的分析[D].成都:四川大学, 2008.

Study on Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) of the MC1R and TYR genes in Guizhou buffalo with different hair color

Ao Qi-yan1,Hu Ling-ling1,Luo Shi-hong1,Zhao Yong-chao1,Wang Zhen1,Liu Ruo-yu1

(1.CollegeofAnimalSciences,GuizhouUniversityKeyLaboratoryofAnimalGenetics,BreedingandReproductioninthePlateauMountainousRegion(GuizhouUniversity),MinistryofEducation,Guiyang, 550025,China)

【Objective】 To promote the scientific protection and exploitation of the buffalo resources in Guizhou, and to provide more scientific basis for breeding. 【Method】In this experiment, the Guizhou grey water buffalo was used as the contrast group, while the Guizhou white water buffalo was used as the experimental group. All DNA samples from the above groups were used to construct the DNA pool, respectively. The MC1R and TYR genes of Guizhou buffalo with different hair color ware used to carry out PCR amplification and scanning single nucleotide polymorphisms (SNPs). Bioinformatics software analysis was used to analyze SNPs loci and their effect of RNA secondary structure and the secondary and tertiary structure of proteins. 【Result】 In the MC1R gene amplification of Guizhou gray buffalo and Guizhou White Buffalo, a missense mutation in exon 1 (T843C), leading valine (Val) to alanine (Ala) was founded, as well as two mutations in exon 1 (C1228T) (synonymous mutation) and exon1 (G1330A) were screened in the buffalo (gray) in Guizhou. In two buffaloes, SNPs identification of TYR gene showed two missense mutations in exon 1 (G826A) and exon5 (T70C), respectively, which resulting arginine (ARG) to histidine (His), leucine (Leu) to isoleucine (ILE), respectively. Besides, a synonymous SNP in exon3 (A83G) was founed.

Guizhou buffalo; MC1R gene; TYR gene; SNPs

2015-02-16 修改日期:2015-03-08

贵州大学“SRT计划”项目

敖啟燕(1993- )，女，贵州福泉人，在读本科生，专业方向：动物科学，E-mail：1225998062@qq.com

刘若余(1963- )，男，湖南邵东人，博士，教授，主要从事分子遗传与动物育种研究工作，E-mail：liury04@163.com

S823.2

A

1001-9111(2015)04-0012-06