哈尼族验方 “莫那奇”对脑出血模型大鼠神经缺损体征及脑组织BDNF阳性细胞数的影响

褚 鑫胡曙华王国栋熊金富程鹏飞蔡恩丽*

1.云南中医学院，云南 昆明 650500；2.云南省墨江县县委党校医务室，云南 墨江 654800

哈尼族验方 “莫那奇”对脑出血模型大鼠神经缺损体征及脑组织BDNF阳性细胞数的影响

褚 鑫1胡曙华2王国栋1熊金富1程鹏飞1蔡恩丽1*

1.云南中医学院，云南 昆明 650500；2.云南省墨江县县委党校医务室，云南 墨江 654800

目的：探讨哈尼族验方 “莫那奇”对大鼠脑出血 （ICH）后神经缺损体征及脑组织中脑源性神经营养因子 （BDNF）阳性细胞数的干预作用。方法：40只SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组和莫那奇组各10只，以自体血注入法建立大鼠ICH模型，以Berderson评分法对其神经缺损体征进行评分，应用原位杂交方法检测干预后BDNF阳性细胞数的变化。结果：与模型组比较，莫那奇组大鼠神经缺损体征有一定程度恢复，脑组织BDNF阳性细胞数显著增加，具有统计学意义 （P＜0.01）。空白组和假手术组基本无阳性表达细胞。结论：哈尼族验方 “莫那奇”促进神经缺损体征恢复和脑组织中BDNF阳性细胞数的增加可能是其治疗脑出血后神经损伤的重要机制之一。

哈尼族；BDNF；脑出血；脑组织修复

脑出血（intra cerebral hemorrhage，ICH）是指原发性脑实质的非创伤性出血，是临床常见的脑血管疾病。ICH后脑损伤的缓解和治疗是临床实践中重要的环节［1］，在降低患者致残率和死亡率、改善患者生活质量方面起重要作用。哈尼族验方 “莫那奇”在长期临床治疗ICH中效果显著，本实验以ICH大鼠模型作为治疗对象，探讨 “莫那奇”对大鼠脑出血 （ICH）后神经缺损体征及脑组织中脑源性神经营养因子 （BDNF）阳性细胞数的干预作用，以揭示其治疗ICH的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康成年昆明种SD大鼠40只，雌雄各20只，体重在220～240g，由昆明医科大学动物实验中心提供，动物质量合格证书号：SCXK（滇）2011-0004。随机分为四组：正常组、假手术、模型组、莫那奇组各10只。实验前动物先在实验室适应环境2周，常规饲养，体重达到250～280g时开始造模；造模前禁食12h，禁水6h；实验中，剔除死亡和不合格者，及时追加动物以补充模型。

1.2 仪器设备与试剂 脑立体定位仪 （深圳瑞沃德生命科技有限公司）；石蜡切片机 （LEICA，德国）；光学显微镜（LEICA，德国）；手术器械 （上海医疗器械集团有限公司）；乙醇 （成都化学试剂厂，分析纯 AR）；水合氯醛（上海试剂公司，分析纯AR），0.1 M PBS（NaCl 9g+ NaH2PO4·2H2O 2.964g+Na2HPO4·12H2O 29.01g+蒸馏水至1000ml）；0.1%DEPC溶液（lmlDEPC+999mlPBS）；4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2～7.6）（多聚甲醛40g+ 0.1%DEPC溶液至1000ml）；BDNF原位杂交试剂盒（武汉博士德公司）；莫那奇汤 （老虎刺皮、黑皮跌打、山皮条、满山香、藤蕉、大荃麻、松节、杨梅皮、天红地绿等各9g，浓度为1200g生药/L）。

1.3 ICH模型的制备和筛选 手术器械消毒备用，参照并改进Rosenberg等［2］报道的方法制作ICH大鼠模型。大鼠造模完成待大鼠清醒后，采用Berderson［3］评分法，筛选成功模型动物。根据Berderson神经体征评分法：轻抓尾巴，提起高于桌面10cm，正常大鼠前爪伸直。0分：无神经功能缺损；1分：脑部病变对侧腕关节、肘关节屈曲，肩内收屈曲；2分：上述体征阳性，向麻痹侧推阻力下降；3分：活动时向麻痹侧打圈 （呈追尾状）。分数在1分以上 （包括1分）即为造模成功。

1.4 各组实验动物干预方法 空白组：10只大鼠，不做任何手术处理，常规饲养，每日灌胃生理盐水1m l，每日1次，连续3d。假手术组：10只大鼠，分别用10%水合氯醛（0.4m l/100g）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上，术中微量注射器沿钻孔进针约6mm，留针约7min，缓慢出针，处理创面，清醒后常规饲养，每日灌胃生理盐水1ml，每日1次，连续3d。模型组：10只，造模后不治疗，常规饲养，每日灌胃生理盐水1m l，每日1次，连续3d。莫那奇组：每日按生药4.5g/kg体重/d给予莫那奇汤灌胃，每日1次，连续3d。各组大鼠在造模3d后重新进行Berderson神经体征评分。

1.5 标本采集 大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4ml/100g深麻醉，顺序灌注生理盐水和4%多聚甲醛/0.1M PBS（PH7.2～7.4）各约200ml，灌注完毕后在冰浴中快速开颅并取出完整脑，距注射针孔前后各约2mm冠状切开，将标本放入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.6 制作石蜡切片 固定脑组织30～40min后冲水2～3h，脱水透明（将脑组织依次浸入70%乙醇3h、80%乙醇2h、90%乙醇过夜、95%乙醇2h、无水乙醇Ⅰ0.5h、无水乙醇Ⅱ0.5h、二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min），浸蜡（将脑组织依次浸入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ各2h），包埋后切片 （片厚5μm）。将切片放入60℃烤箱2h。

1.7 原位杂交检测BDNF 石蜡切片常规脱蜡，滴加3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶，后固定，预杂交，杂交，洗涤，滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，滴加生物素化过氧化物酶，DAB显色，必要时苏木素复染，充分水洗，脱水，透明，封片。

1.8 图像分析 利用病理图像分析软件，在400倍光镜下，随机选取每张切片ICH血肿周边5个不同视野，阳性细胞呈褐色或棕黄色，区分各切片所选视野内阳性细胞并计数。

1.9 统计学处理 使用统计软件进行数据分析，各组数据用±s表示，各组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐时选用LSD法，方差不齐时选择秩和检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Berderson神经体征评分比较 莫那奇组、模型组大鼠均表现不同程度的出血对侧偏瘫，莫那奇组与模型组比较差异具有统计学意义 （P＜0.05）。空白组和假手术组大鼠无神经功能异常。见表1。

表1 各组大鼠Berderson神经体征评分的比较 （n=10，±s）

表1 各组大鼠Berderson神经体征评分的比较 （n=10，±s）

注：莫那奇组与模型组各时间点比较，*P＜0.05。

组别 莫那奇组 模型组 假手术组 空白组神经体征评分0.8±0.63*1.3±0.82 0.0±0.0 0.0±0.0

2.2 各组大鼠脑组织BDNF阳性细胞数的比较 莫那奇组、模型组分别与空白组、假手术组进行比较，BDNF阳性细胞数差异具有统计学意义 （P＜0.01）；与模型组比较，莫那奇组大鼠脑组织BDNF阳性细胞数显著增加，具有统计学意义（P＜0.01）。空白组和假手术组基本无阳性表达细胞。见表2。

表2 各组大鼠脑组织BDNF阳性细胞数的比较（n=10，±s）

表2 各组大鼠脑组织BDNF阳性细胞数的比较（n=10，±s）

注：莫那奇组与模型组各时间点比较，▲P＜0.01。

组别 莫那奇组 模型组 假手术组 空白组阳性细胞数18.5±3.44▲7.80±1.93 1.50±0.97 0.40±0.70

3 讨论

脑出血是中老年人多发病种，起因复杂，病理机制尚不明确，并发症和后遗症多，其高发病率、高致残率和高死亡率给病患生活带来极大困扰，因此也是广大医务工作者和基础科研的重点研究对象。

临床上脑出血急性期多采用手术疗法，如开颅清除血肿、降颅压、穿刺抽吸血肿、血性脑液引流等，一般疗法包括吸氧、控制血压、降温、防治并发症等辅助措施，但老年人由于体质弱、耐受差、术后易感染，不宜施行手术，因此寻找安全有效的疗法对中老年患者十分必要。传统医药治疗脑出血有丰富的经验积累，能有效减轻出血后脑组织损伤程度，提高患者生活质量，目前应用较多的传统方法多为中草药制剂，如川芎嗪、羚角钩藤汤、镇肝熄风汤等［4］。

哈尼族医药作为祖国传统医药的重要组成部分，已有数千年的发展历史，其以多样的疗法和显著的疗效，有力地保障了哈尼族的文明延续，备受哈尼人民尊重。墨江县委党校医务室胡氏之 “莫那奇”，哈尼族用语，意为 “中风、风湿麻木很好的药”。莫那奇由哈尼族民族民间草药为主组成：老虎刺皮 （骆铭傲割阿孜）、黑皮跌打 （啊纳呃积赤）、山皮条 （呃壳呃积）、满山香 （约茅腻）、藤蕉（札柯倍都耶）、大荃麻 （和茄榪）、松节 （托自阿尼）、杨梅皮 （昔切呃积）、天红地绿 （咪呢秘尼）等 （括号内药名为哈尼用语）。主要功效为活血化瘀、行气止痛、通经活络。其中天红地绿、满山香、藤焦等辛辣芳香，为健脾理气之品，能行气活血；黑皮跌打、杨梅皮、老虎刺皮、山皮条等有活血止血的功效。哈尼医药与中医药理论有许多相通和相似之处，为现代医学对其研究提供了很好的契机。研究表明，脑出血后脑内瘀血、水肿、血红蛋白毒性、继发性脑缺血等多种因素致使胞内凋亡信号通路激活，氧自由基增加，最终导致细胞凋亡或死亡。BDNF是最重要的脑源性神经营养因子［5］，广泛分布于神经系统中，有促进神经元生长发育、保护和修复损伤的作用［6-7］。生理状态下BDNF阳性细胞表达较少，ICH出血灶周围组织中BDNF阳性细胞数量显著增多，BDNF表达上升，其受体TrkB与BDNF表达协同上调，有实验证实，BDNF通过激活其受体TrkB，阻断胞内损伤因子对蛋白激酶C的失活，来防止神经元发生变性、死亡［8］。石秋艳等［9］研究发现，ICH后诱导BDNF蛋白表达，有利于对损伤NCs的保护和修复。本实验中，莫那奇汤组与对照组相比，大鼠神经缺损体征有一定程度的恢复，有统计学意义，脑出血病灶周围组织中BDNF阳性细胞数量增加显著，由此推断，莫那奇汤促进脑组织BDNF的表达，有利于损伤神经元的保护和修复，可能是其治疗脑出血的机制之一。

［1］皮志杰.脑出血的病因病理变化及治疗进展 ［J］.咸宁学院学报 （医学版），2009（05）：457-458.

［2］Gary A Rosenberg，S Mun-Bryce，M Wesley，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21（5）：801.

［3］Bederson JB，Pitts LH，TsujiM.Ratmiddle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472.

［4］焦健，徐淑娜.羚羊钩藤汤临证加减治疗高龄脑出血患者临床研究［J］.中国实用神经疾病杂志，2015（07）：21-23.

［5］SchabitzWR，Steigleder T，Cooper-Kuhn CM，et al.Intravenous brainderived neurotrophic factor enhances poststroke sensorimotor recovery and stimulates neurogenesis［J］.Stroke，2007，38（7）：2165-2172.

［6］Melina LWillsom，Catriona Mcelnea，Jean Mariani，etal.BDNF increases homotypic olivocerebellar reinnervation and associated finemotor and cognitive skill［J］.Brain，2008，131（4）：1099-1112.

［7］Xing-Yun Song，Fang Li，Feng-He Zhang，et al.Peripherally-derived BDNF promotes regeneration of ascending sensory neurons after spinal cord injury［J］.Pl One，2008，3（3）：1707.

［8］周晖，毛萌.脑源性神经营养因子对缺氧胚鼠脑皮质神经元的保护作用［J］.华西医大学报，2002，33（4）：573-576.

［9］石秋艳，何俊芳，孙惠芳.脑出血大鼠脑内NGF和BDNF蛋白表达变化的研究［J］.中国医药指南，2010（07）：8-10.

The Intervention of the Neural Symptoms and the Counts of Brain-Derivedneurotrophic Factor Positive Expression Cells after Experimental Intracerebral Hemorrhage（ICH）in Rats Taken the“Monaqi”Prescription of Hani Nationality

CHU Xin1，HU Shuhua，WANG Guodong1，XIONG Jinfu2，CHENG Pengfei2，CAIEnli1*
1.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China；2.The Committee Party School Infirmary of Mojiang County in Pu'er City，Mojiang 654800，China

Objective To study the intervention of the neural symptoms and the counts of brain-derived neurotrophic factor positive expression cells after experimental intra cerebral hemorrhage（ICH）in rats taken the“Monaqi”prescription of Hani nationality. Methods 40 rats were random ly divided into normal control group，sham operated group，ICH model group and“Monaqi”group. With themethod of injecting autologous blood to produce the ICH model，the counts of brain-derived neurotrophic factor positive expression cells was detected by in situ hybridization.Results Compared with themodel set，the counts of the positive expression cells of brain-derived neurotrophic factor was increase obviously in the“Monaqi”set，and had the statistical significance（P＜0.01）. There were no expression of brain-derived neurotrophic factor in the normal control group and sham operated group basicly.Conclusion By taking the“Monaqi”prescription of Hani nationality to the ICH rats can promote the recovery of the brain tissues，and increase the counts of brain-derived neurotrophic factorpositive expression cellsmaybe one of the importantmechanisms.

Hani Nationality；Brain-derived Neurotrophic Factor；Intracerebral Hemorrhage；Recovery of the Brain Tissues

R29

A

1007-8517（2015）23-0003-02

2015.10.12）

云南白药、云南中医学院中医药教育创新基金项目（项目编号：YB2014505）。

褚鑫 （1984-），男，助理实验师，研究方向：中西医结合基础。

蔡恩丽 （1972-），女，教授，研究方向：中西医结合临床。