Box－Behnken效应面法优化玄参的提取工艺

孙莉君马 婧杨 静胡海涛王 越

1.大庆市人民医院，黑龙江 大庆 163316；2.大庆市食品药品检测中心，黑龙江 大庆 163316

Box－Behnken效应面法优化玄参的提取工艺

孙莉君1马 婧1杨 静1胡海涛2王 越1

1.大庆市人民医院，黑龙江 大庆 163316；2.大庆市食品药品检测中心，黑龙江 大庆 163316

目的：应用Box－Behnken效应面法优化玄参的提取工艺。方法：以乙醇体积分数、溶媒比、提取时间为自变量，以总评“归一值”（包括安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷的含量及浸膏率）作为因变量，对自变量的各个水平采用二项式拟合，用Box－Behnken效应面法对提取工艺进行优化。结果：玄参的最优提取工艺为：提取时间75min，溶媒比为8倍，82%的乙醇，提取2次。二项式拟合复相关系数高（r＝0.9777），回归模型的预测值与测定值的偏差率为－2.51%。结论：Box－Behnken效应面法优选的玄参提取工艺，合理可行，操作简便。

玄参；提取工艺；Box－Behnken效应面法

玄参（Radix Scrophulariae）为玄参科（Scrophulariaceae）玄参属植物玄参（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥根［1］。玄参味甘、苦、咸，性微寒，具有清热凉血，泻火解毒，滋阴的功效。临床主要用于温邪入营，内陷心包，温毒发斑，热病伤阴、舌绛烦渴等症。现代研究发现，玄参根中含生物碱、糖类、氨基酸、甾醇、脂肪酸等成分［2］，具有保肝［3］、降血压、保护心脏［4］、抗菌［5］、降血糖［6］等多种药理活性。为了合理利用玄参的药用资源，实验以玄参中主要药效成分安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷的含量及浸膏率为考察指标，应用Box－Behnken响应面法对玄参进行工艺优化，旨在为玄参的合理应用与开发提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC－20AT型高效液相色谱仪（N2000双通道色谱工作站，日本岛津）；METTLER ME104电子分析天平（上海梅特勒－托利多仪器有限公司）；101A－3B型电热恒温鼓风干燥箱（武汉亚华电炉有限公司）、PL－S30型超声波清洗器 （东莞康士洁超声波科技有限公司）。

1.2 材料 玄参药材购自黑龙江省药材公司，经大庆食品药品检验中心鉴定为玄参科植物玄参（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥根。哈巴俄苷对照品（批号：111730－201205，中国食品药品检定研究院）；安格洛苷C对照品（批号：061209）、哈巴苷对照品（批号：090320）均购自上海尚谊化工科技有限公司。乙腈为色谱 （天津恒兴化学试剂制造有限公司），水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷含量的测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex luna（250mm× 4.6mm，5.0μm）；流动相：乙腈（A）－水（B）梯度洗脱（0～5min，A：5%→30%；5～7min，A：30%→50%；7～ 20min，A：50%→60%；20～25min，A相60%→75%）；检测波长：哈巴俄苷、安格洛苷C为280nm，哈巴苷为210nm；流速：1.0ml／min；进样量：10μl，柱温：35℃。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取安格洛苷C、哈巴苷、哈巴俄苷对照品适量，置于5ml量瓶，用甲醇溶解后稀释到刻度，摇匀，即制成安格洛苷C 0.62mg／ml，哈巴苷0.46mg／m l，哈巴俄苷0.58mg／ml的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取玄参5g，置于250ml圆底烧瓶，加适量乙醇，回流法提取适当时间，过滤，残渣同法提取，合并滤液后减压浓缩，甲醇溶解并定容至20m l，摇匀，过微孔滤膜，即得。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下的混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml置10ml量瓶，甲醇定容，摇匀。取10μl按“2.1.1”色谱条件测定。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，制作标准曲线，得回归方程如下：哈巴苷Y＝95384X＋226941（r＝0.9997），在0.023～0.46mg范围内线性关系良好；安格洛苷C Y＝592655X－43685（r＝0.9998），在0.031～0.62mg范围内线性关系良好；哈巴俄苷Y＝536974X＋201232（r＝0.9993），在0.029～0.58mg范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 取“2.1.2”项下混合对照品溶液10μl，重复进样6次，按上述色谱条件测定，结果哈巴俄苷、哈巴苷、安格洛苷C峰面积的RSD值分别为1.3%、0.98%、1.25%，表明该仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0、3、6、12、24h进样测定，结果哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C峰面积的RSD分别为1.26%、1.05%、0.91%，说明该样品在24 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 称取同一样品，平行制备得到供试溶液6份，按上述色谱条件测定，结果哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C含量平均值（n＝6）分别为2.62%、0.285%、0.183%，RSD分别为0.99%、1.2%、1.4%，表明该方法具有良好重复性。

2.1.8 加样回收率试验 分别精密称取9份已知哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C含量的玄参药材粗粉各5g。分别准确加入哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C对照品溶液适量，制备低、中、高三个质量浓度样品，按上述 “2.1.3”项下制备供试品溶液，按“2.1.1”色谱条件测定。哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C平均回收率分别为98.27%（RSD为1.3%）、101.5%（RSD为1.7%）、100.8%（RSD为1.6%）。说明该方法回收率良好。

2.2 玄参提取工艺的优选

2.2.1 试验设计 在单因素实验基础上选取乙醇体积分数、溶媒比、提取时间和提取次数为考察因素。由于提取次数属于非连续变量，难以回归分析，结合实际应用及文献［7－9］，将提取次数定为2次。每个自变量的低、中、高水平分别以－1，0，1进行编码，因素水平见表1。以玄参中主要有效成分哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C的含量及浸膏得率为评价指标，试验安排及结果见表2。采用 “归一化法”［10］和Hassan方法［11］对各指标进行数学转换，计算公式如式①：

di＝（Yi-Y min）／（Y max-Y min） ①总评“归一值”（overall desirability，OD），计算公式如式OD＝（d1×d2……dn）1／n ②

表1 Box－Behnken因素设计水平

表2 Box－Behnken试验设计及结果

2.2.2 模型和方差分析 使用Design－Expert 7.0软件进行二项式拟合，模型如下：

Y＝0.55＋1.25×10－3X1＋0.14X2－0.15X3＋0.045X1X2－0.099X1X3＋0.035X2X3－0.086X12－0.087X22－0.16X32（r＝0.9777）

由表3可知，提取时间和溶媒比对结果的影响非常显著，X32的偏回归系数非常显著，X12和X22的偏回归系数显著。模型拟合检验结果非常显著能够说明该方程较为符合实际情况。回归方程失拟检验不显著，说明模型误差较小，模型可用。

表3 回归方程的方差分析

2.2.3 工艺条件优化与预测 根据二次多项式模型，作响应曲面图，根据所拟合的响应曲面形状，乙醇体积分数、提取时间、溶媒比对玄参中各主要成分含量及浸膏得率的影响，响应面图见图1～3。根据已建的模型，得最佳条件

图1 提取时间，体积分数及其相互作用对结果影响的响应面

图3 溶媒比，提取时间及其相互作用对结果影响的响应面

2.2.4 验证试验 按照以上得到的最佳工艺条件进行验证试验（n＝3），结果得到安格洛苷C含量为0.236%（RSD为2.36%）；哈巴苷含量为3.136%（RSD为1.96%）；哈巴俄苷含量为0.362%（RSD为1.82%）；浸膏得率为22.18%（RSD为1.69%）；总评归一值为0.622，最大预测值为0.638，偏差率为－2.51%，说明本模型可靠，具有较好的预测性。

3 讨论

目前，中药及复方的提取工艺多采用正交设计和均匀设计，但二者的实验次数偏少，存在精度低的缺点［12］。响应面法因模型拟合度高，实验结果准确，在中药及复方的提取工艺中越来越受到关注。实验采用Box－Behnken效应为提取时间74.66min，溶媒比7.86倍，体积分数为82.11%。考虑实际生产情况及操作的可行性，将各因素条件进行微调，最终确定玄参最佳提取工艺为溶媒比8倍，乙醇体积分数82%，提取2次，每次75min。面法对玄参的提取工艺进行了优化，得到的结果准确，模型预测性良好，为玄参的工业化提取提供了实验依据，同时也为起临床的合理应用奠定了基础。

图2 溶媒比，体积分数及其相互作用对结果影响的响应面

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典 （一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：108－109.

［2］李媛，宋宝安，杨松，等.中草药玄参化学成分的研究 ［J］.天然产物研究与开发，2012，24（1）：47－51.

［3］孙奎，姜华.玄参中苯丙素苷对肝细胞损伤保护作用的研究 ［J］.药学实践杂志，2002，20（4）：234－235.

［4］顾伟梁，陈长勋，王樱，等.玄参水提物对心室重构大鼠心肌纤维化的影响［J］.中草药，2008，39（9）：1371－1374.

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［6］郭建辉.孙文亮主任医师重用玄参治疗糖尿病足溃疡经验 ［J］.中医临床研究，2013，5（21）：74.

［7］韦正，杨丽，李旻，等.Box－Behnken效应面法优化陈皮中橙皮苷及川陈皮素提取工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（10）：17－20.

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［12］周辉.均匀设计法优化金线吊葫芦黄酮类化合物乙醇提取工艺 ［J］.福建农林大学学报（自然科学版），2013，42（5）：539－542.

Optim ization of Extraction Technology for Radix Scrophulariae by Box－Behnken Response Surface M ethodology

SUN Lijun1MA Jingi1YANG Jing1HU Haitao2WANG Yue1
1.Daqing People's ital Heilongjiang Daqing 163316 China；2.Daqing Municipal Food and Drug Inspection Center Heilongjiang Daqing 163316 China

Objective：To optimize extraction technology of Radix Scrophulariae by Box－Behnken design.M ethods：To take the extraction time，solvent ratio and the ethanol concentration as independent variables，and take overall desirability as dependent variable（including the content of angorosideC，harpagide，harpagoside and extract yield），binomial formula was used to fit each level of independent variables，optimizing extraction process by Box－Behnken design and prediction was carried out through comparing observed and forecasted results.Results：Optimal extraction technology as follows：extracted 2 times for 75 minutes each time with 8 times amount of 82%ethanol.Regression coefficient of binomial fitting complexmode1 was as high as 0.9777.Bias between observed and predicted valueswas－2.51%.Conclusion：Optimal extraction process of Radix Scrophulariae was stable and reasonable.

Radix Scrophulariae；extraction proces；Box－Behnken response surfacemethod

R284.2

A

1007－8517（2015）20－0011－03

2015.07.17）