蛋白质纯化分析仪校准方法及其不确定度评定*

金有训 石莲花 武利庆 王 晶

(中国计量科学研究院，北京 100029)



蛋白质纯化分析仪校准方法及其不确定度评定*

金有训 石莲花 武利庆 王 晶

(中国计量科学研究院，北京 100029)

本文研究建立了一种蛋白质纯化分析仪的校准方法，确定了蛋白质纯化分析仪的主要计量特性包括泵系统的流量设定值误差SS、流量稳定性极差SR、紫外-可见检测器的基线噪声和基线漂移、仪器整机性能的定性、定量测量重复性、pH和电导测定重复性等。介绍了采用人生长激素溶液标准物质、氯化钾电导率标准溶液和pH标准溶液对仪器主要计量特性指标进行校准的过程，并对流量设定值误差的不确定度评定进行了讨论。本研究工作有助于保证蛋白质纯化分析仪测定结果的准确性和溯源性，并为蛋白质纯化分析仪校准规范的制定奠定基础。

蛋白质纯化分析仪；计量特性；校准；不确定度

0 引言

蛋白质是生物体中广泛存在的一类生物大分子，由核酸编码的a -氨基酸之间通过a -氨基和a -羧基形成的肽键连接而成的肽链，经翻译后加工而生成的具有特定立体结构的、有活性的大分子。随着生命科学和生物技术的发展以及生物产业的兴起，蛋白质纯化分析在临床检验、食品安全、医药等领域的应用与日俱增，蛋白质纯度与大众健康紧密相连。许多重要的临床生化指标都离不开蛋白质的纯化及纯度分析，并且临床检验仪器的检定和校准同样也离不开高纯度蛋白质标准物质。

蛋白质纯化分析仪根据所要纯化的目的蛋白的特性，利用液相色谱结合不同的色谱柱可以进行凝胶过滤、离子交换、疏水层析、反相层析和亲和层析，可用于分离和纯化各种生物分子，包括天然蛋白质，重组和融合蛋白质、肽、寡核苷酸、质粒、病毒、抗生素、生物碱等，可以检测、分离、纯化环境微生物、植物、动物和人体中的多种生物分子[1-3]。尤其适用于检测、纯化、分离制备蛋白质，包括已知和未知蛋白质的纯化，蛋白药物的分离，病毒等生物颗粒的分离[4]。显然蛋白质纯化分析仪的性能将会影响到蛋白质检测、分离、纯化的最终结果。

因此，为了保证分析结果的准确，有必要对蛋白质纯化分析仪的性能进行校准和质量控制。迄今为止，国家尚未出台有关蛋白质纯化分析仪的检定规程或校准规范，并且蛋白质纯化分析仪的需求和数量是日益增长的，确保其结果的准确性和溯源性有必要对仪器性能进行校准和质量控制。因此，本工作对蛋白质纯化分析仪的计量特性指标及其校准方法进行了研究，并对计量特性指标中流量设定值误差的不确定度评定进行了讨论，满足了蛋白质纯化分析仪的质量控制和校准的需求。

1 计量特性和计量标准

蛋白质纯化分析仪通常采用高效液相色谱原理，它是由泵系统、进样器、色谱柱(柱温箱)、紫外-可见 (UV-Vis) 检测器、在线电导和pH检测的组合检测器和数据处理装置等部分组成。蛋白质纯化分析仪利用样品中各组分在色谱柱内固定相和流动相间分配或吸附特性的差异，由流动相将样品带入色谱柱中进行分离，经检测器检测，依据各组分的保留时间和响应值(峰面积或峰高)进行定性和定量分析。泵系统是蛋白质纯化分析仪中很重要的部件之一，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。考虑到蛋白质纯化分析仪的泵系统流量是否稳定可能影响到蛋白质纯化分析仪检测、分离、纯化结果的准确度和精密度，特别是影响到定性定量的准确性。因此，参照JJG 705—2014 《液相色谱仪检定规程》，将泵系统的流量设定值误差SS和流量稳定性极差SR作为一项计量特性。检测器是蛋白质纯化分析仪的关键部件之一，其中紫外-可见检测器的基线噪声和基线漂移都会影响测定结果的准确度，尤其是影响到定性定量的准确性和精密性，因此，将紫外-可见检测器的基线噪声和基线漂移作为计量特性之一[5]。仪器整机性能的定性、定量测量重复性好坏也会影响到定性定量的准确性，也应作为计量特性之一。此外，pH和电导率重复性[6]稳定也将影响到蛋白质纯化分析仪检测、分离、纯化结果的准确度和精密度，也将其性能作为计量特性。通过参考相关的检定规程和查阅大量技术资料，我们反复做了相关计量特性有关的实验，最终确定了蛋白质纯化分析仪泵系统的流量设定值误差SS、流量稳定性极差SR、紫外-可见检测器的基线噪声和基线漂移、仪器整机性能的定性、定量测量重复性、pH和电导测定重复性等作为计量特性。各种计量特性指标要求见表1和表2。校准过程中使用的计量标准和计量仪器如表3所示。

表1 泵流量设定值误差SS和泵流量稳定性极差SR的指标要求

表2 蛋白质纯化分析仪的主要技术指标

表3 蛋白质纯化分析仪校准过程中使用的计量标准与计量仪器

2 校准方法

实验室环境应当满足仪器安装的要求，周围无强烈机械振动和电磁干扰源，仪器接地良好，蛋白纯化分析仪周围环境的温度应当控制在15～30℃，相对湿度在20%～85%环境中进行测试，配套使用的流动相应当新鲜配制。接通仪器电源后预热10 min，待仪器各电子器件状态稳定后开始测试。然后按照下述步骤进行实验。

2.1 泵流量设定值误差Ss、流量稳定性极差SR的检测

蛋白质纯化分析仪流量设定值误差Ss、流量稳定性极差SR检测的相关步骤以及计算公式是参照JJG 705—2014 《液相色谱仪检定规程》，以纯水为流动相，按表1指标的要求，启动仪器，压力稳定后，在流动相出口处用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，自动收集设定时间流出的流动相，在分析天平上称重，重复测量3次，按式(1)、式(2)和式(3)计算SS和SR。

Fm= (W2-W1)/(ρ(t)

(1)

(2)

(3)

2.2 基线噪声和基线漂移的检测

以纯水为流动相，流量为1.0mL/min，紫外检测器的波长选在215nm，检测灵敏度调到最灵敏挡。开机预热，待仪器稳定后记录基线30min，计算基线噪声，用检测器自身的物理量(AU) 作单位表示。基线漂移用30min内基线偏离原点的值(AU/30min) 表示。

2.3 电导率重复性的检测

开机后先用纯水以5mL/min流速清洗系统5min，然后，用氯化钾电导率溶液标准物质[6]预平衡系统，重复测量标准溶液共6次，记录仪器的电导率，按式(4)计算相对标准偏差作为重复性的表征。

(4)

2.4 pH重复性的检测

测pH重复性时先用纯水以5 mL/min流速清洗系统5 min，然后，用pH标准溶液预平衡系统，重复测量pH标准溶液pH值共6次，记录仪器的pH值，按式(4)计算相对标准偏差作为重复性的表征。

2.5 整机性能的定性、定量重复性的检测

参照JJG 705—2014《液相色谱仪检定规程》，将仪器各部分连接好，选用凝胶过滤、离子交换色谱、疏水作用色谱、亲和层析色谱等色谱柱，选择相适应的流动相和测量参数，检测波长为215nm，基线稳定后由注射器注入50μL的1mg/mL人生长激素溶液标准物质进行测试。连续测量6次，分别记录色谱图中相应的保留时间和峰面积，根据式(4)，以峰面积的相对标准偏差计算定量重复性，以保留时间的相对标准偏差计算定性重复性。

3 不确定度评定

本研究对泵流量设定误差进行了不确定度评定。根据上述分析，其数学模型为式(1)。由数学模型可知，流量设定误差校准不确定度的来源主要有流动相质量 (W2-W1)、流动相的密度 (ρ)、时间 (t)、测量重复性 (rep)。其不确定度分量包括：u(W1)、u(W2)、u(ρ)、u(t)、u(rep)。

3.1 流量重复性引入的不确定度分量u(rep)

采用不确定评定A类方法对流量重复性分量进行评定，按式(1)计算流量Fm，重复测量3次，用极差法可简单迅速算出标准偏差，一般在n<10时采用，根据极差法公式(5)计算出标准偏差为：

(5)

式中：xmax为同一设定流量3次测量值的最大值，mL/min；xmin为同一设定流量3次测量值的最小值，mL/min；dn为是极差系数，测量次数3时相应的极差系数是1.69。

其平均标准偏差为：

流量重复性引入的不确定度分量：

3.2 称量引入的不确定度分量u(w1)、u(w2)

采用不确定评定B类方法对称量时所引入的W2、W1进行评定，天平最大允许误差为0.01 mg，假设为均匀分布、则由称量引入的不确定度分量为：

3.3 密度引入的不确定度分量

采用不确定评定B类方法对密度所引入的不确定度分量进行评定，密度最大允许误差为1×10-6，因此，对密度引入的不确定度分量忽略不计[7]。

3.4 时间引入的不确定度分量

因仪器自动记录收集时间，可以忽略。

3.5 标准合成不确定度

灵敏系数ci按式(6)计算：

ci=∂f/∂xi

(6)

根据数学模型各参数的灵敏系数为：

按B类方法评定的合成不确定度为：

将以上不确定度分量合成得到标准合成不确定度:

3.6 测量扩展不确定度

在最佳测量能力条件下，取包含因子k=2，则流量引用的扩展不确定度为：U=2×uc。

4 结论

随着目前分析仪器行业飞速发展，这就要求检定员在仪器检定过程中不断摸索改进，对现有方法进行补充完善，提高检定规程/校准规范的可操作性。既要制定对新分析仪器的严谨科学的检定校准方法又要尽量满足客户的需求，使检定校准方法向着快捷、实用、科学的方向发展。本文提出了蛋白质纯化分析仪校准方法，能够实现泵系统的流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR、紫外-可见检测器的基线噪声和基线漂移、仪器整机性能的定性、定量测量重复性，仪器pH和电导率重复性等蛋白质纯化分析仪计量性能指标的综合评价。依据本文提出的蛋白质纯化分析仪校准方法，笔者起草了中国计量科学研究院蛋白质纯化分析仪作业指导书，对外开展蛋白质纯化分析仪测试业务，先后在蛋白质纯化分析仪上进行了实验，获得了满意的效果。

[1] 杨伟华.利用FPLC法纯化棉花Rubisco.植物生理学通讯，1995，31(2)

[2] 刘萍，徐建民，金茜，等.江浙蝮蛇毒抗血小板聚集组分的分离纯化及活性分析.中国实验血液学杂志，2004，12(2)

[3] 李卫党，周宝宏.犹春辉.人重组白细胞介素一8的快速纯化.镇江医学院学报，1997，7(2)

[4] 王文英，刘德新，李小鹰，等.快速蛋白液相色谱系统阴离子交换层析纯化人抗地高辛单链抗体.军医进修学院学报，2005，26(4)

[5] 国家质量监督检验检疫总局.液相色谱仪检定规程(JJG 705—2014).北京：中国质检出版社，2014

[6] 国家质量监督检验检疫总局.电导率仪检定规程(JJG 376—2007).北京：中国计量出版社，2008

[7] 周湄生.最新温标纯水密度表.计量技术，2000(3)

中国计量科学研究院国际比对专项(2013-25)

10.3969/j.issn.1000-0771.2015.07.14