Rho家族在肾脏足细胞细胞骨架调节中的作用

贺 蓉，李贵森

(1.遵义医学院，贵州 遵义 563000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院肾脏内科，四川 成都 610072)

Rho家族在肾脏足细胞细胞骨架调节中的作用

贺 蓉1，2，李贵森2△

(1.遵义医学院，贵州 遵义 563000；2.四川省医学科学院·四川省人民医院肾脏内科，四川 成都 610072)

足细胞在肾小球疾病的发生和发展中有重要地位，尤其局灶性节段性肾小球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)等。FSGS 作为一种典型的足细胞病，其损伤可以发生在多个环节上，包括细胞骨架(cytoskeleton)的破坏、细胞核内转录因子的异常、胞浆内线粒体能量代谢异常、细胞内钙离子动态稳定性的改变及裂孔隔膜上其他成分的异常等，其中足细胞骨架结构的变化是FSGS重要的发病机制。细胞骨架是真核细胞维持生命活动的重要成分，Rho家族(如RhoA、Cdc42、Rac1等)在细胞骨架动态变化调节中发挥着重要的作用。Rho 家族蛋白介导的信号通路异常可能影响足细胞的细胞骨架稳定，进而破坏足细胞的正常结构，从而导致FSGS的发生和进展。

局灶性节段性肾小球硬化症；细胞骨架；Rho家族

足细胞在维持肾小球的结构和功能完整性中起重要作用。既往研究表明，几种足细胞相关蛋白，如辅肌动蛋白4(a-actinin-4)[1]、肾病蛋白(nephrin)[2]、磷脂酶Cε基因(the phospholipase C epsilon gene)[3]和瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6)[4]等的编码基因突变，会影响肾小球滤过屏障紊乱和肌动蛋白细胞骨架重排，导致肾脏疾病的发生，其中足细胞骨架的动态调控是维持肾脏正常滤过至关重要的的条件。微丝(microfilaments，MFs)和微管(microtubules，MTs)是细胞骨架的两个主要系统，它们在细胞内形成支持网络，进而维持细胞形态。传统观点认为，MTs 系统在细胞分裂和胞内运输过程中起关键作用，而 MFs 对细胞迁移和贴壁等功能至关重要。最近研究发现，MFs 还可以调控细胞凋亡、衰老和基因表达，从而赋予了MFs 的细胞生长调控功能。在足细胞中，MFs结构是以肌动蛋白为基础，并与α-actinin-4 、Synaptopodin 和肌球蛋白等共同组成具有精细调节和收缩作用的足细胞肌动蛋白微丝骨架。因此，稳定的肌动蛋白细胞骨架是维持足细胞正常结构和功能的首要条件[1]，而Rho家族中small GTPase分子如RhoA、Rac1以及Cdc42分子是调节细胞骨架的重要分子[5]。研究发现，在足细胞里表达的肌动蛋白调节蛋白(GTPase-activating protein，GAP)，通过与Rho家族中small GTPase分子RhoA、Rac1以及Cdc42作用，调节着细胞骨架的稳定[6]。本文主要对 Rho家族中small GTPase分子参与足细胞骨架的调节及致病作用作一综述。

1 Rho家族

Rho GTPase是Ras超家族的成员之一，已发现Rho GTPase具有完全不同于Ras且甚至与Ras相反的功能作用。研究证实Rho GTPases是细胞骨架肌动蛋白的重要调节子并能影响脊椎动物细胞形态，且发现许多至关重要的细胞进程如通过c-JunN-末端激酶(JNK)信号通路的转录调节、诱导凋亡、细胞周期调控及维持Ras-转染细胞的转化表型等都涉及Rho GTPases[7～9]。与Ras相似，Rho GTPas-es能调节GDP/GTP循环改变，3种重要的蛋白有序地调控Rho蛋白的功能活性(图1)：促进GDP向GTP转化的蛋白-鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanosine nucleotide exchange factors，GEFs)；增加GTPase水解活性的蛋白-GAPs；抑制GDP解离的蛋白-GDP解离抑制因子(GDP dissociation inhibitors，GDIs)。

目前已从哺乳动物细胞中分离出16种不同的Rho GTPases，分别是Rac1、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、RhoA、RhoB、RhoC、RhoE/Rnd3、RhoG、Rnd1/Rho6、Rnd2/Rho7、RhoD/HP1、TTF/RhoH、Chp和Rif[10]。另外，发现GEFs和GAPs数目大量增加，每类均超过20个成员，这使Rho GTPase参与的信号通路的调控极为复杂。目前众多的研究集中在Rho GTPases家族成员中的Cdc42、Rac1和RhoA分子。用哺乳动物成纤维细胞或其它细胞系统如白血病细胞和神经细胞为模型的研究，已确定上述几种蛋白主要影响细胞骨架肌动蛋白[11]。在成纤维细胞，Cdc42促进丝状伪足的形成而有利于细胞对外环境的适应，Rac1调节层状伪足的生成及膜皱缩，RhoA则促进焦点连接和张力纤维的装配。

2 Rac1的作用机制

Racl全称是 Ras 相关的 C3 肉毒素底物1(related C3 botulinum toxinsubstmte 1)，其基因全长 29kb，其定位于人染色体 7p22，包含 7 个外显子，属于 Rho家族蛋白中 Rac 亚家族成员之一[12]。Racl在细胞运动与黏附、细胞的增殖分化与凋亡、肿瘤的侵袭与转移以及免疫调节等方面都发挥了重要的作用[13]。与其它小G蛋白相同，Rac1有两种转换形式，GDP失活状态与GTP活性状态，而Rac1的GDP与GTP形式的转换是GAPS调节的结果(图2)。如Rho GTP酶激活蛋白 1(RhoGAP1)、RICS Rho GTP酶激活蛋白32(p200RhoGAP)、Rho GTP酶激活蛋白9(ARHGAP9)、活性BCR相关基因(Active BCR-related gene，ABR)、断裂点簇集区(Breakpoint cluster region，BCR)、嵌合素(Chimerin 2，B-chimaerin)和RalA结合层白1(RalA binding protein 1，RalBP1)，它们激活Rac1，从而抑制G-proteins。抑制GDP解离的蛋白GDIs，如RhoGDI alpha 和LyGDI 都在细胞骨架系统里发现，Rac1的GDP形式通过GDIs调节，具体机制现在不清楚，同时GEFs促使Rac1的GDP形式的形成，GEFs包括DBL、Tiam1、ECT2、ARHGEF2等相关因子。GAPs、GEFs、与GDIs的活性受多种因子的调节，目前它们确切的通路研究还不是很清楚[14，15]。哺乳动物的Rho GTP酶Rac1与 Cdc42的是控制许多细胞活动的分子开关，但最显著的是它们在肌动蛋白的调控中对细胞骨架的动态调节。

足细胞复杂的细胞骨架系统的稳定是维持肾脏滤过屏障的基础。对于Rac1在生理状态下及病理状态下维持足细胞细胞骨架中的作用也做了一些研究。有研究表明，采用足细胞特异性表达Cre-LOX的技术，使有正常足细胞形态的小鼠缺失Rac1，但发育到成年后，足细胞的功能未受影响；但是构建急性足细胞损伤的硫酸鱼精蛋白的模型，使足细胞Rac1特异性缺失，足细胞足突突融合受到了阻碍；而且在慢性高血压肾小球损害的模型，Rac1的丧失导致蛋白尿出现和肾小球硬化程度加剧[16]。另一个研究表明[17]，Rac1的激活阻碍了足细胞的成熟，ARHGAP24基因，属于GTP酶激活蛋白中的一种蛋白，被发现它的突变形式与人类家族性FSGS有密切的关系，ARHGAP24通过影响RhoA信号通路下游的因子，抑制Rac1的活性和伪足形成；在小鼠的足细胞中敲除ARHGAP24基因后增强的细胞膜的边缘波动性，也增加了Rac1和Cdc42的活性；另有研究发现，缺乏Rho GDP解离抑制因子(RhoGDIα，使Rho家族处于非活性状态)的小鼠，出现了大量的蛋白尿，足突融合[18，19]。

3 Cdc42的作用机制

Cdc42全称为细胞分裂周期蛋白42(celldivision cycle 42)，大小为25×103，又称G25k。其基因定位于1p36.1。Cdc42是一种鸟嘌呤三核苷酸(GTP)酶，像Ras超家族的所有成员一样，Rho家族蛋白在非活性GDP结合形式和活性GTP结合形式之间循环(图2)，Cdc42的GEFs包括FYVE、RhoGEF、FGD1、Frabin、ECT2、ASEF2、DOCK6、Zizimin1、DOCK11、DBS、DEF6、DBL、ACK1。GAPs通过催化水解GTP为抑制Cdc42的活性，主要的GAPs包括RHG7、Rich1、CDGAP、BCR、ABR、RalBP1、B-chimaerin、DAG、p200RhoGAP、Fyn、RhoGAP5、p120gAP、FGFR1 NIP2及RhoGAP1[20，21]。Rho GDP 解离抑制因子RhoGDI alpha、LyGDI、RhoGDI gamma 抑制Cdc42的活性，Cdc42在肿瘤方面研究比较多，以往的研究表明Cdc42在肝癌中、肺部腺癌中、胃癌中高表达[21]。Cdc42 蛋白在细胞骨架动态变化调节中发挥着重要的作用，而细胞骨架的变化影响细胞的各种功能，突出影响到细胞迁移与细胞极化[22]。Cdc42 蛋白对细胞骨架动态变化的调节是一个复杂的信号传递过程，涉及到 Rho 家族蛋白介导的信号通路以及其他多条信号通路间的相互作用。Cdc42 蛋白通过诱导细胞肌动蛋白聚合，对肌动蛋白细胞骨架发挥调节作用。Cdc42 蛋白能调节肌动蛋白聚合的信号传导过程如下：Cdc42 蛋白激活p65PAK 蛋白激酶，使后者获得丝氨酸/苏氨酸激酶活性，导致与 p65PAK 蛋白结合的肌动蛋白发生重排[23，24]。

研究表明，敲除Cdc42的小鼠足细胞两周后出现蛋白尿，并且与正常足细胞足突架构相关连的nephrin 和 podocin蛋白在足细胞上异常分布，进而影响细胞骨架的结构。紧接着肾小球硬化，肾小管间质严重损伤，进一步肾功能衰竭而死亡。足细胞缺乏Cdc42而Rac1正常的小鼠，丝切蛋白处于非磷酸化水平；因为Cdc42可以激活LIM激酶以促进丝切蛋白磷酸化，磷酸化的丝切蛋白可以与肌动蛋白结合进而发挥作用；另有研究发现，在腓骨肌萎缩神经病变和FSGS的患者中发现了INF2基因的突变，在HEK-293T细胞中定点突变INF2后发现，Cdc42的活性增强并与突变的INF2结合，这样导致了Cdc42的错误定位并加剧了细胞骨架系统的瓦解[25，26]。

4 RhoA的作用机制

细胞骨架结合蛋白之一的 RhoA 蛋白，是细胞内重要的信号转导分子之一，具有 GTP 酶活性。文献报道，RhoA 主要通过调控 MFs 的重组参与细胞增殖、迁移和凋亡等过程。RhoA途径可以被不同的GEFS激活(图2)，如胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信号分子，促进胰岛素样生长因子1受体(IGF-1 receptor)的活化，并形成复杂的Rho(GEF)12(LARG)的形式，G蛋白家族α-Q/ 11和α-12可以与LARG结合从而促进RhoA的激活，活性的RhoA可刺激PTK2蛋白质酪氨酸激酶2(FAK1)，磷酸化LARG，从而提高的RhoA的活性，此外，G蛋白的α-12家族可以通过刺激的Rho GEF 1[ARHGEF1(p115RhoGEF)]从而激活RhoA；肝配-A与肝配-A受体结合，并与神经元鸟嘌呤核苷酸交换因子(Ephexin)结合，从而激活RhoA；研究发现，有几种GAPs参与Rho的负性调节[27]：肌球蛋白IXB，Rho GTP酶激活蛋白26(GRAF)，Rho GTP酶激活蛋白1(RhoGAP1)和Rho GTP酶激活蛋白(p200RhoGAP)；p200RhoGAP与p250 gAP，它与RhoA呈负性调节关系，研究表明，ARHGAP32基因为神经元RhoGAP蛋白，并被Fyn磷酸化[28～30]。Fyn是Src家族的蛋白酪氨酸激酶的成员，在神经元和少突胶质细胞之间发挥重要的作用。在少突胶质细胞中，磷酸化似乎增强p250 gAP和Fyn的之间的相互作用。此外，p250 gAP的酪氨酸磷酸化的水平增加时的少突胶质细胞系CG4的分化，Fyn的激活，使少突胶质细胞成熟上调，因此 p250 gAP由Fyn酪氨酸磷酸化并调节RhoGAP活性，导致少突胶质细胞的形态和表型的改变。足细胞是间充质样细胞，在肾脏发育时期起源于上皮前体，它由形态和功能不同的三部分组成，分别是细胞体、主要突起和足突，足突上含有肌动蛋白细胞骨架并与肾小球基底膜相连，肾小球上皮细胞，足突，肾小球基底膜组成了肾脏滤过的最后一道防线，人突触足蛋白(Synaptopodin)，是一种富含脯氨酸，与肌动蛋白相联接，并在有活性的细胞成分如神经元的树突和肾小球足突上表达的一种特异性蛋白[31]；因此人突触足蛋白可以被描述为通过连接裂缝隔膜(SD)和基底膜域(BMD)并结合到辅肌动蛋白和肌动蛋白细胞骨架上发挥作用的一个支架蛋白，应力纤维是细胞骨架一个重要的组成成分，研究表明，Rho家族—特别是RhoA的激活，是形成应力纤维的一个重要的条件，RhoA的及其它小分子G蛋白的活性受核苷酸负荷的调节，在GTP形式下，Rho GTP酶获得的活性构象，促使应力纤维的形成，反之，Rho家族的GDP形式促使G蛋白的失活[32，33]。

研究表明，在转基因小鼠中用多西环素诱导足细胞的RhoA的活性形式发现：用多西环素诱导足细胞的RhoA活性形式的小鼠产生了显著的蛋白尿；此外，蛋白尿的程度和肾小球的病理变化与RhoA的表达水平有关：在光镜下，RhoA的表达水平低的一组没有观察到肾小球的节段性足突融合，而更高水平的RhoA活性的表达均观察到广泛的足突融合和局灶节段性肾小球硬化(FSGS)。此外，诱导RhoA的表达显著上调纤维连接蛋白和胶原IA1的mRNA在肾小球的表达，上调的程度与蛋白尿的水平有关。对于大多数小鼠，多西环素的撤离导致蛋白尿的下降，除了一些大量蛋白尿的小鼠。这些数据表明，在足细胞中RhoA的活化形式会导致蛋白尿的产生并伴随着肾脏一系列的病理变化最终发展为FSGS[34]。

图2 Rho家族与足细胞骨架的关系

5 小结

细胞骨架的改变可以导致足细胞的裂孔的改变并介导细胞 F-actin 的重新分布。而Rho家族通过对肌动蛋白调控来实现对细胞骨架的动态调节。足细胞作为肾脏结构和功能中最重根据细胞之一，Rho家族分子，尤其是Rac1、cdc42和RhoA在维持其细胞骨架中起了重要作用。多种FSGS致病基因(如TRPC6、INF2、ARHGAP24等)的突变均可以影响Rho GTP酶的变化，从而通过破坏足细胞骨架的稳定性来致病。因此，深入研究细胞骨架的重要的信号分子RAC1、Cdc42、RhoA与FGGS突变基因的的关系，可以进一步了解FSGS的发病机制。

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Rho family and the regulation of podocyte cytoskeleton

HE Rong1，2，LI Gui-sen2

国家重点基础研究发展计划(973计划)基金资助项目(编号：2012CB517604)

R692.6；R394.2

B

1672-6170(2015)03-0183-04

2015-01-24；

2015-03-11)

△通讯作者