猪圆环病毒2型贵州株ORF1基因的生物信息学分析

杨利勇，李春凤，周继勇

（1.浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州310058；2.贵州福斯特生物科技有限公司，贵州 贵阳550014）

猪圆环病毒（Porcine cirvovirus，PCV）属圆环病毒科圆环病毒属，被国际病毒分类委员会（ICTV）第6次学术报告列为一个新的病毒。PCV 最早在PK－15 细胞中发现，开始认为是一种细胞污染物[1－2]。PCV分为2个主要的基因型，即PCV1 与PCV2型，其中PCV2被认定是导致仔猪断奶后多系统衰竭征（PMWS）的主要病原[3]。PCV2常与细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪肺炎支原体 （MPS）、伪狂犬病毒（PRV）混合感染，造成猪的免疫失败[4－5]。PCV2基因组有11个开放性阅读框，其中ORF1是PCV2基因组中最大的阅读框，编码病毒复制相关蛋白（Rep）[6]，Rep蛋白能被原核表达系统所表达[7]，为在蛋白水平上研究Rep 蛋白提供了良好的工具。将体外表达的ORF1编码蛋白与表达粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子的真核表达质粒联合免疫猪群，能起到抵抗PCV2攻击的作用，表明针对ORF1基因编码蛋白的抗体可能具有中和病毒的作用[8]。鉴于此，笔者针对PCV2ORF1基因序列设计1对特异性引物，以PCV2阳性病料所提DNA 为目标，获取PCV2贵州株（PCV2－GZ）ORF1基因，并分析其生物信息学特性，旨在为后续的疫苗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病料及试剂

PCV2贵州株（PCV2－GZ）阳性病料，由贵州大学动物疫病研究所保存。DNAiso Reagent提取试剂盒，pMD18－T 载体，dNTPs，200bp DNA Marker，Amp，购自大连宝生物有限公司；Gel Extraction Kit（50×）胶回收试剂，E.Z.N.ATMPlasmid Mini Kit质粒提取试剂盒，购自OMEGA 公司；Taq酶，购自北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶（BamH Ⅰ、HindⅢ），购自MBI公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 引物的设计与合成

参考GenBank 登录PCV2 代表性毒株ORF1基因序列，以Prime 5.0软件设计针对ORF1基因的 特 异 性 引 物， P－F： 5′－ATGCCCAGCAAGAAGAATG－3′， P－R：5′－TCAGTAATTTATTTCATATGGAA－3′，大小945bp，由上海捷瑞生物有限公司合成。

1.3 目的基因的获取、克隆及序列测定

PCV2－GZ阳性病料无菌研磨处理后，按DNA提取试剂盒说明书提取病料总DNA，以总DNA 为模板，用引物P－F／P－R 进行PCR 扩增。反应体系：引物（10pmoL／μL）各2μL，10×PCR Buffer（含MgCl2）5μL，dNTP（10 mmol／L）1 μL，Taq 酶（5U／μL）1μL，灭菌双蒸水补足50.0μL。反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35 个循环；72℃延伸10 min。取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以胶回收试剂盒纯化回收目的基因。按常规T 载体克隆方法进行重组质粒构建及PCR；将扩增片段克隆到pMD18－T中，所得重组质粒以EcoRⅠ／HindⅢ进行双酶切鉴定；将初步鉴定为阳性的重组质粒进行测序。

1.4 PCV2ORF1 生物信息学分析

用DNAStar软件对PCV2－GZ 与国内外毒株（表）进行ORF1 基因核苷酸、氨基酸同源性分析，并分别分析其编码蛋白的α－螺旋、β－折叠、T－转角、无规则卷曲及亲水性、表面可及性和抗原指数，对蛋白二级结构和B 细胞抗原表位进行预测，用Karplus－Schulz方法预测其柔性区域；用MegAlign软件绘制系统进化树，比较分离株亲缘关系；用InterProScan软件分析蛋白结构域；用SWISS－Model软件预测蛋白的三维空间结构。

表 PCV2 ORF1核苷酸序列的登录信息Table The genbank accession information of different PCV2strains

2 结果与分析

2.1 目的基因的扩增

从 图1 可 知，PCV2－GZ 阳 性 病 料 经PCV2ORF1特异性引物扩增出945bp的特异性条带，与预期扩增片段大小相符。

图1 PCV2 ORF1基因的PCR 扩增电泳图谱Fig.1 PCR results of ORF1PCV2

2.2 重组质粒酶切鉴定

经双酶切鉴定，电泳检测到961bp和2 692bp的2条谱带（图2），酶切结果与预期相符，初步证明所克隆的目的基因成功插入pMD18－T 载体，可进行后续基因序列测定。

图2 重组质粒的双酶切结果Fig.2 The double digestion of restructuring plasmid

2.3 PCV2－GZ ORF1基因序列

经测序，PCV2－GZORF1基因全长945bp，编码Rep蛋白共314个氨基酸（图3）。测序结果登陆GeneBank，获取登录号为KF152883。

2.4 ORF1基因的同源性

经同源性分析，PCV2－GZORF1基因与其他14株毒株的核苷酸同源性为96.8%～99.7%，与国内HUB－5和ZJ－38的同源性最高，均为99.7%。推导的氨基酸序列同源性，PCV2－GZ编码的Rep蛋白与韩国P710－1和国内HUB－5、SC－10、ZJ－38株的较高，均为99.4%。

2.5 系统进化树

从图4可知，PCV2－GZORF1基因与国内毒株相应序列同属于一个分支，而与国外毒株（韩国P710－1株）的亲缘关系相距较远。

图3 PCV2－GZORF1 基因的序列Fig.3 The sequeces of the PCV2－GZ ORF1gene strain

图4 PCV2 ORF1基因的核苷酸系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of ORF1gene nucleotide

图5 PCV2－GZ Rep蛋白的二级结构Fig.5 Secondary structure prediction of PCV2－GZ Rep protein

2.6 Rep蛋白的二级结构及抗原表位

经预测，Rep蛋白柔性区域呈散在性分布，以β－折叠、T－转角和无规则卷曲为主（图5）。可能的抗原表 位区为N 端第2～18 位、23～34 位、86～98位、159～167位、189～205位、287～297位（图6），推测PCV2－GZ Rep蛋白可形成优势抗原表位。

图6 PCV2－GZ Rep蛋白的抗原表位Fig.6 Epitope prediction of PCV2－GZ Rep protein

图7 PCV2－GZ ORF1基因Rep蛋白的结构域Fig.7 The Rep protein domain of ORF1gene of PCV2isolation GZ

图8 PCV2－GZ ORF1基因Rep蛋白的三维结构Fig.8 The Rep protein domain of ORF1gene of PCV2isolation GZ

2.7 蛋白结构域及蛋白三维结构

从图7 可知，PCV2－GZ Rep 蛋白第171～257位氨基酸处存在解旋酶；在N 端15～100位氨基酸处存在病毒复制相关蛋白；在111～285位氨基酸处存在P－loop，是dNTP 结合的位点，具有潜在的ATP水解酶功能，且不存在跨膜结构和信号肽。

经预测，PCV2－GZORF1基因Rep蛋白含有β－折叠和T－转角（图8）。

3 结论与讨论

Rep蛋白由PCV 最大的开放阅读框ORF1编码，ORF1 基因由病毒的正向链转录而成，与PCV基因组滚环复制相关[9]。Rep蛋白和Rep’蛋白是PCV 病毒复制所必需。PCV1Rep基因的启动子位于728～838位核苷酸区域[10]。Rep 蛋白具有与典型滚环复制（RCR）相关的3个保守结构，分别为Ⅰ（FTLNN）、Ⅱ（HLQG）、Ⅲ（YCSK）以及结合dNTPs的P环（P－loop）结构（序列为G－GKS），对维持Rep蛋白的功能至关重要，缺失或突变均会影响病毒的复制[11]。PCV2Rep基因位于第51～995位核苷酸，含有945个碱基，编码315个氨基酸，编码病毒复制相关蛋白。PCV1与PCV2相比，氨基酸序列同源性达86%，但Rep 蛋白相对比较保守，2种血清型PCV 病毒有抗原交叉。曾朔等[12]研究表明，圆环病毒Rep基因可能是原核生物解旋酶编码基因间的重组产物。

研究结果表明，PCV2－GZORF1 基因全长为945bp，编码314个氨基酸，与国内外流行毒株的同源性（98.1%～99.4%）较高。核苷酸序列与国内毒株的同源性较高，可能是由于近年来贵州畜牧业的快速发展，大量跨区引种，猪群流动性增加所致[13]。Rep蛋白是PCV 病毒在复制早期利用宿主细胞的蛋白合成系统，由自身基因组上的ORF1 转录、翻译及加工而成，主要功能是在截短蛋白Rep’的协同作用下，启动和终止病毒DNA 滚环式复制[14]。Rep蛋白不存在于病毒粒子中，在体外培养细胞（如PK－15）中含量也较少，要获取足量的一定纯度的天然Rep蛋白变得极为困难，一般采用体外表达来获取该蛋白[15]。利用软件对PCV2－GZORF1 基 因Rep蛋白结构预测表明，Rep蛋白可形成优势抗原表位，且不存在跨膜结构和信号肽，推测可进行PCV2ORF1基因的全基因表达[16]。

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