双水相体系萃取啤酒酵母中乙醇脱氢酶工艺

吕凯波，吴士筠，张晟（武汉工商学院，湖北武汉430065）

双水相体系萃取啤酒酵母中乙醇脱氢酶工艺

吕凯波，吴士筠*，张晟
（武汉工商学院，湖北武汉430065）

摘要：研究构建聚乙二醇（PEG）/硫酸铵[（NH4）2SO4]双水相体系对乙醇脱氢酶（ADH）进行提取。探讨了PEG分子量、PEG浓度、（NH4）2SO4浓度、粗酶添加量对ADH纯化倍数的影响。结果表明，在（NH4）2SO4浓度为18%、PEG800浓度为22%、粗酶添加量为5%所组成的双水相体系下，ADH的纯化倍数可达3.815。

关键词：ADH；PEG/（NH4）2SO4；双水相萃取

乙醇脱氢酶（ADH）属氧化还原酶第一亚类，是以NAD+、NADP+或PQQ为辅酶，作用于-CHOH基团，催化伯醇和醛之间可逆反应的一种含锌金属酶[1-3]。由于ADH为胞内酶，故市场上ADH多来源于动物肝脏，虽提取纯化工艺较成熟，但是动物肝脏资源较少，且价格昂贵不易保存，产品远远不能满足市场需求。啤酒厂废弃啤酒酵母中含有大量的ADH，收集废弃酵母进行酶的提取，可以减少资源的浪费，变废为宝[4]。

本研究构建了聚乙二醇（PEG）/硫酸铵[（NH4）2SO4]双水相体系对废弃啤酒酵母中ADH进行萃取分离，探讨了PEG分子量、PEG质量分数、（NH4）2SO4质量分数、粗酶添加量对ADH纯化倍数的影响，为工业化提取生产ADH提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

啤酒酵母泥：由武汉工商学院环境与生物工程实验教学分中心提供。

辅酶Ⅰ（NAD+）、牛血清白蛋白BSA：厦门星隆达试 剂 公司 ；PEG800、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000、考马斯亮蓝G-250、固体硫酸铵[（NH4）2SO4]：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

GL-21M高速冷冻离心机：长沙湘麓离心机仪器有限公司；TY96-Ⅱ超声波细胞破碎仪：上海比朗仪器有限公司；SPX-150-Ⅱ生化培养箱：上海贺德实验设备有限公司；722E型可见分光光度计、752型紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司；JM-A2002电子天平：诸暨市超泽衡器设备有限公司；101-2AB型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1酵母菌制备

10%豆芽汁培养基制备：参考文献[5]进行配置。

酵母菌制备：将废弃啤酒酵母接种于培养基中，28℃、180 r/min震荡培养24 h后，转接至相同成分培养基中扩大培养48 h到对数期，取发酵液于4℃、10 000 r/min离心15 min，收集菌体，用蒸馏水冲洗2次得到酵母菌。

1.2.2粗酶液制备[6]

采用玻璃珠联合超声波破碎法破壁处理，10 000 r/ min冷冻离心10 min，得到上清液即为乙醇脱氢酶（ADH）粗酶液。

1.2.3PEG/（NH4）2SO4双水相体系的建立[7]

根据体系总质量及加入的（NH4）2SO4、PEG质量，计算出（NH4）2SO4和PEG在系统中的质量百分浓度（g/g）。

1.2.4双水相萃取操作方法[8]

测定相比R、上下相中的酶活力及蛋白质含量。

1.2.5蛋白质测定[9]

采用马斯亮兰G-250法测定蛋白质浓度。

1.2.6ADH酶活力的测定[10]

定义每分钟A340增加0.001为1活力单位（U）。

1.3纯化倍数的计算[11]

以ADH纯化倍数来探究双水相最佳提纯条件，ADH提取相（下相）中的纯化倍数计算公式：

式中：Et是ADH提取相活性单位，units/mL；Pt是ADH提取相总蛋白质浓度单位，μg/mL；Ei是ADH粗酶液活性单位，units/mL；Pi是原酶液总蛋白质浓度单位，μg/mL。

2　试验结果与讨论

2.1蛋白质标准曲线的制作

按1.2.5的试验方法绘制蛋白质标准曲线见图1。

图1　牛血清蛋白标准曲线Fig.1　The standard curve of BSA

由图1可知，蛋白质标准曲线为：y=0.061x+0.106，R2=0.998 6。蛋白浓度在20 μg/mL～100 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2双水相体系成相物质对ADH酶活力的影响

2.2.1不同分子量PEG对ADH酶活力的影响

配制质量浓度为 20%的 PEG400、PEG800、PEG1000、PEG2000、PEG4000溶液。吸取5 mL PEG溶液放入试管中，加入0.5 mL粗酶液混匀，静置10 min后测定酶活力，计算PEG溶液中酶活力和粗酶液酶活力之比，试验结果如图2所示。

图2　PEG分子量对ADH酶活力的影响Fig.2　The influence of PEG molecular weight on the ADH enzyme activity

由图2可知，ADH活性基本与粗酶液酶活力相近，在PEG2000加入时甚至高于粗酶液，说明不同分子量PEG对ADH酶活力影响不明显[12]。

2.2.2不同浓度（NH4）2SO4对ADH酶活力的影响

配制浓度梯度为15%、20%、25%、30%、35%、40%的（NH4）2SO4溶液，吸取5 mL（NH4）2SO4溶液放入试管中，加入0.5 mL粗酶液混匀，静置10 min后测定酶活力，计算（NH4）2SO4中溶液酶活力和粗酶液酶活力之比，试验结果如图3所示。

图3　（NH4）2SO4浓度对ADH酶活力的影响Fig.3　The influence of（NH4）2SO4concentrations on the ADH enzyme activity

由图3所示，随（NH4）2SO4浓度增加，溶液中的ADH活性下降，这是由于（NH4）2SO4的盐析作用使ADH被（NH4）2SO4沉淀。（NH4）2SO4浓度在15%～25%之间是对ADH酶活力影响不大。

2.3双水相体系萃取ADH最佳条件确定

2.3.1双水相体系中最佳PEG分子量确定

按1.2.3方法建立（NH4）2SO4浓度为20%，PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG2000溶度均为20%双水相体系，粗酶添加量为5%。按1.2.4方法进行试验，计算纯化倍数，结果如图4所示。

图4　不同分子量的PEG对纯化倍数的影响Fig.4　The influence of PEG molecular weight on the purification multiples

由图4可知，当PEG分子量为800时，酶纯化倍数最高3.563。由于下相蛋白质含量低酶活力高，可见ADH主要分配在下相中。故双水相萃取提取ADH时，使之尽可能分配在下相，选择PEG800作为成相组分。

2.3.2双水相体系中最佳PEG浓度确定

按1.2.3方法建立（NH4）2SO4浓度为20%，PEG800浓度分别为14%、16%、18%、20%、22%、24%双水相体系，粗酶添加量为5%。按1.2.4进行试验，试验结果如图5所示。

图5　PEG800的浓度对纯化倍数的影响Fig.5　The influence of PEG800 concentration on purification multiples

由图5可知，在14%～22%范围内，纯化倍数随PEG800浓度增加而升高，当PEG800浓度为22%时，纯化倍数最高4.113。当PEG800浓度提高到24%时，下相当中蛋白质浓度高，且酶活力迅速降低，导致纯化倍数降低，故选择PEG800浓度为22%为最佳。

2.3.3双水相体系中最佳（NH4）2SO4浓度确定

按1.2.3方法建立PEG800浓度为22%，（NH4）2SO4浓度为12%、14%、16%、18%、22%，粗酶添加量为5%的双水相体系，按1.2.4方法进行试验，结果如图6所示。

图6　（NH4）2SO4浓度对纯化倍数的影响Fig.6　The influence of（NH4）2SO4concentrations on purification multiples

由图6可知，当（NH4）2SO4浓度逐渐升高时，ADH纯化倍数先增大后减小。当浓度为18%时，酶的纯化倍数达到最大值4.602。这是由于随着（NH4）2SO4浓度质量分数的增加，无机盐的盐析作用加强，ADH更趋向分配于上相，下相蛋白质浓度降低[13]。故选取双水相体系中（NH4）2SO4最佳浓度为18%。

2.3.4最适粗酶加入量确定

按1.2.3方法建立PEG800浓度为22%，（NH4）2SO4浓度为18%，粗酶添加量为1%、3%、5%、7%、9%的双水相体系，按1.2.4方法进行试验，结果如图7所示。

图7　粗酶添加量对纯化倍数的影响Fig.7　The influence of crude enzyme additives on purification of multiples

由图7可知，随着粗酶添加量的增加，酶的纯化倍数先增大后减小。当粗酶添加量为5%时，酶纯化倍数最高达到3.857，故选取粗酶添加量为5%为最适添加量。

2.3.5验证试验

建立PEG800浓度为22%、（NH4）2SO4浓度为18%、粗酶添加量为5%的双水相体系，固定双水相体系质量为20 g，摇匀，静置2 h后测量纯化系数。3次试验结果为3.634、3.708、4.102，平均值为3.815，表明萃取的条件优化是有效的。

3　结论

本研究采用PEG/（NH4）2SO4双水相系统对ADH进行萃取分离，探究了成相组分对酶活力的影响，确定双水相最佳萃取体系，并进行了验证试验。试验过程中发现双水相萃取过程中上相（PEG）基本无酶活力，但蛋白质浓度较高，而下相（（NH4）2SO4溶液）中蛋白质浓度低，酶活力较高，结果表明：PEG分子量为800、PEG浓度为22%、（NH4）2SO4浓度为18%、粗酶添加量为5%时双水相体系的ADH纯化倍数较高，多次为试验平均纯化倍数为3.815。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.017

收稿日期：2015-10-26

作者简介：吕凯波（1982—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：食品加工及贮藏。

*通信作者：吴士筠（1950—），女（汉），高级实验师，学士，研究方向：生物化学。

The Technology of Alcohol Dehydrogenase Extraction from Beer Yeast by Aqueous Two-phase Systems

LÜ Kai-bo，WU Shi-jun*，ZHANG Sheng
（Wuhan Technology and Business University，Wuhan 430056，Hubei，China）

Abstract：This study build polyethylene glycol（PEG）/ammonium sulfate[（NH4）2SO4]two water phase systemextraction on ADH.The influences of PEG molecular weight，PEG concentration，（NH4）2SO4concentration and crude enzyme additives on purification multiples were further investigated.The results showed that the purification multiples of ADH was 3.815 when the aqueous two-phase system were 18%（NH4）2SO4，22.0% PEG800 and 5%crude enzyme additives.

Key words：ADH；PEG/（NH4）2SO4；the aqueous two-phase system extraction