茶树炭疽菌的鉴定及致病力分析

刘 威,叶乃兴,刘 伟,金 珊,连玲丽,赖建东,谢运海

(1.福建农林大学园艺学院/茶学福建省高等学校重点实验室 ,福建福州350002；2.信阳农林学院茶学院 ,河南信阳464000；3.福建农林大学茶叶科技与经济研究所；4.福建农林大学生命科学学院 ,福建福州350002)

茶树炭疽菌的鉴定及致病力分析

刘 威1 ,2,叶乃兴1 ,3,刘 伟3,金 珊1 ,3,连玲丽4,赖建东1,谢运海1

(1.福建农林大学园艺学院/茶学福建省高等学校重点实验室 ,福建福州350002；2.信阳农林学院茶学院 ,河南信阳464000；3.福建农林大学茶叶科技与经济研究所；4.福建农林大学生命科学学院 ,福建福州350002)

通过PCR扩增并测定福建省不同产地茶树上分离的炭疽病菌的β-Tub2、ITS、GDPH和ACT 4段基因序列 ,采用多基因系统发育分析 ,结合其纯培养、分生孢子、附着孢等形态特征对分离菌进行鉴定 ,并采用离体法测定菌株的致病力.结果表明:5株供试病原菌分离物均为Gloeosporium cingulata f.sp.camelliae ,为茶树炭疽病病原菌 ,它们的培养性状和形态特征都相似.致病力测定表明 ,所有分离物均对茶树叶片致病 ,但其中一株致病力明显强于其余菌株 ,且致病力强的菌株与其余菌株的基因序列存在差异.

茶树；炭疽菌；病原鉴定；强致病力；多基因系统发育

炭疽病是一种真菌侵染引起的植物病害 ,在世界各茶区茶树上均有发生.茶树是我国南方重要的经济作物之一 ,炭疽病的发生给部分茶区带来较大损失 ,其可造成茶树树势衰落、茶叶产量与品质降低.炭疽病致病菌种类繁多 ,不同种之间生物学特性存在差异 ,因此鉴定该病的病原菌是病害防治的首要问题.Miy-ake[1]将在日本茶树上发现的炭疽病菌鉴定为Gloeosporium theae-sinensis；魏景超[2]报道该种病原菌可侵染我国茶树并引起炭疽病.国内外已报道能侵染茶树的炭疽病致病菌有Colletotrichum camelliae、C.gloeospori-oide、C.crassipes等[3－5].刘威等[6－7]在福建茶树上发现和证实C.fructicola与C.gloeosporioide可侵染茶树并引起炭疽病 ,为茶树炭疽病的病原菌.同一地区不同炭疽菌种的致病力存在一定差异 ,不同地区同一炭疽菌种的致病力也存在一定差异[8].我国对茶树炭疽病病原菌的鉴定多以形态特征和症状为依据 ,较少采用多基因系统发育分析进行鉴定.而形态特征不仅易受环境影响 ,而且一些不同种炭疽菌形态差异并不明显 ,因此将分子生物学技术与形态学结合使研究结论更加可靠[9－10].本研究在对我国南部几个地区茶树炭疽菌进行分离培养、致病性测定时 ,发现5株致病力相对较强的炭疽菌株 ,采用分子生物学和形态学相结合的方法对其进行鉴定 ,并测定其致病力 ,以期为茶树炭疽病的综合防治及抗病育种提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 供试菌株

于2012年6－9月分别从福建省福州市、宁德周宁县、泉州安溪县和永春县4个地区采集不同茶树品种炭疽病典型病叶标本 ,利用组织分离法从病叶上分离病原菌 ,经单孢分离获得纯培养菌株 ,编号为ZRG、YFS、ZHD、ABS和FHG的5株炭疽菌株 ,并通过接种测定确认为茶树炭疽病致病菌.以上各菌株均用PSA培养基保存在4－8℃冰箱内备用.

1.2 纯培养与形态性状

借鉴刘威等[6]的方法进行各菌株纯培养特征、菌落生长速度、分生孢子和附着孢形态和大小等的研究.菌株命名参考文献[11－16].

1.3 致病力测定

采用Koch′S法[17]离体测定致病力.将分离到的病原菌在PSA平板培养基上培养直至产孢 ,加无菌水制成孢子悬浮液 ,用孢子悬浮液对茶树叶片进行有伤口接种和无伤口接种.具体方法:选取成熟叶片 ,清水洗涤干净 ,在超净工作台中用5%次氯酸钠溶液浸泡1 min ,75%酒精浸泡3 min ,无菌水清洗3次后自然风干 ,备用.每片叶脉两侧各设3个点 ,共4个有伤口接种点、1个无伤口接种和1个有伤口接种无菌水(CK) ,每个菌株3次重复.将接种叶片置于26℃、湿度为95%、12 h光暗交替的人工气候箱中培养 ,每隔1－2 d观察症状 ,测量并记录第8天的病斑直径 ,描述病斑特点并拍照.

1.4 菌丝DNA的提取与PCR扩增

将供试菌株分别接种到液体培养基中培养并收集菌丝 ,液氮研磨后参考Chen et al[18]的方法提取菌丝体基因组DNA.采用引物Bt2a/Bt2b[19]、ITS1/ITS4[20]、GDF/GDR[21]、ACTF/ACTR[21]对菌株的DNA进行PCR扩增 ,分别获得β-Tub2、rDNA-ITS、GPDH和ACT等4段基因.ITS基因PCR扩增反应体系及组分: 50 μL反应体系 ,其中10×PCR缓冲液(含Mg2＋)5 μL、dNTP 4 μL、上下游引物各1 μL(10 μmolűL－1)、rTaq DNA聚合酶0.5 μL、DNA模板为5 ng ,ddH2O 38.5 μL.PCR反应程序:94℃预变性4 min；94℃50 s、55℃50 s、72℃1 min ,共30个循环；最后72℃延伸10 min.其余3段基因PCR反应体系及反应程序除退火温度外与ITS基因相同.反应结束后取5 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测.

1.5 PCR产物的纯化、克隆和测序

利用DNA回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)回收PCR扩增产物 ,回收后的DNA经PM-Dl8-T vector连接后转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中 ,经蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定阳性转化子 ,穿刺接种后 ,送往上海华大基因科技有限公司进行碱基测序.测序所得的各菌株各段基因序列上传到NCBI (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GenBank中 ,获得20个登录号(表1).

1.6 多基因系统发育树的构建

将供试菌株各基因序列首尾相连 ,连接顺序为β-Tub2—ITS—GPDH—ACT.从GenBank数据库中下载相关炭疽菌β-Tub2、ITS、GPDH和ACT基因序列作为参考序列(表1) ,以相同的方法将各基因首尾相连.采用Mega 5.1软件邻近(neighbor-joining ,NJ)法构建系统发育树 ,以自展法(bootstrap)进行检测 ,共循环1000次.

2 结果与分析

2.1 致病性及致病力测验结果

2.1.1 菌株致病性测验结果 致病性测验结果显示 ,有伤口的茶树叶片分别接种ZRG、YFS等5株供试菌后 ,均能观察到病斑(图1).将病斑组织分别用PSA培养基重新分离和培养 ,获得与原接种菌株一致的菌落 ,产生的分生孢子与原接种菌株形态特征一致.无伤口接种和有伤口接种无菌水(CK)处理均未发现病斑(图1) ,对接种处组织进行分离 ,未见菌落生长 ,说明供试菌株仅能从伤口侵染茶树叶片.上述接种测验步骤符合Koch′S法则 ,表明供试菌是茶树炭疽病的病原菌.

表1 从GenBank下载的供试基因序列1)Table 1 Sequences obtained from GenBank used in the analysis

图1 接种ZRG和YFS菌后的茶树叶片病斑特点Fig.1 Symptoms of tea plant leaves inoculated ZRG and YFS Colletotrichum

2.1.2 菌株致病力测验结果 茶树叶片室内接种5株菌3 d后 ,均在叶片接种部位开始发病 ,病斑近似圆形 ,逐渐扩展 ,病斑处呈褐色.10 d后叶片表面开始着生胶质状的橘红色分生孢子团.病斑直径测量(第8天)结果显示 ,接种菌株ZRG的病斑直径最大 ,为10－15 mm ,而接种其他4株菌的病斑直径为3－7 mm ,说明菌株ZRG的致病力强于其余4株菌(图1).

2.2 茶树炭疽菌形态特征

供试5株菌感染茶树叶片的特征相似 ,病斑浅灰色 ,凹陷 ,呈半叶型 ,病斑处薄且易破碎(图2A、B).分生孢子盘寄生于茶叶表皮下 ,后期穿破表皮形成无色分生孢子 ,有刚毛(图2G) ,刚毛褐色 ,有隔.

图2 茶树炭疽菌形态特征Fig.2 Morphological characteristics of G.cingulata f.sp.camelliae

供试5株菌在PSA培养基上的纯培养特征相似 ,在26℃、黑暗条件下培养 ,生长速度为1.06－1.34 cműd－1,菌落白色、灰白色 ,隆起(图2C) ,气生菌丝发达 ,边缘较整齐；背面土色、黑色 ,像有黑色素沉积.分生孢子堆浅黄色或粉红色 ,分生孢子长椭圆、椭圆形 ,部分为花生形 ,顶端钝圆 ,表面粗糙 ,有黑色颗粒；无色 ,2－3个油球；(12.5－17.5)×(2.5－7.5)μm(图2D).分生孢子附着孢梨形、不规则形；边缘黑色 ,表面黑色颗粒明显 ,(5.5－15.0)×(5.0－9.5)μm(图2E、F).依据病原菌的培养性状和形态特征 ,参照文献[16－18]的描述 ,初步将供试5株茶树炭疽病病原菌鉴定为G.cingulata f.sp.camelliae.

2.3 炭疽菌的分子鉴定

多基因系统发育分析结果(图3)显示 ,5株寄主为茶树的炭疽菌与C1291、ICMP10646 2个菌株以较高的支持率聚在类群Ⅰ中.结合其形态特征 ,将其鉴定为G.cingulata f.sp.camelliae ,其中菌株ZRG与其余4株菌存在一定的基因差异.rDNA-ITS序列聚类分析与多基因系统发育分析结果相似 ,其中ZRG与其余4株菌的ITS序列差异明显.DNAman 6.0多基因序列比对结果显示 ,各菌株ITS序列一致性为99.44% ,菌株YFS、AHD、FHG和ABS的ITS基因序列一致性达100% ,与菌株ZRG之间存在16个碱基变异 ,分别为13、30、40、43、56、65、72、80、181、250、348、372、468、469、487、565基因位点.5株菌的GPDH和ACT基因序列差异完全一致 ,菌株FHG的Tub2基因序列与其余菌株的序列相比存在一个碱基变异.

3 讨论

Hyde et al[22]研究表明 ,炭疽菌核糖体DNA-ITS序列保守性较高 ,部分不同种炭疽菌的ITS序列差异不明显 ,基于病原菌形态学和ITS序列分析的方法在炭疽菌分类研究中还不够完善 ,易造成误判.形态学方法结合多基因系统进化分析是未来炭疽菌分类研究的重要手段[25－28].本研究测定了供试菌株的β-Tub2、ITS、GDPH、ACT等基因序列 ,最终证明基于这4段基因序列的多基因系统发育分析能准确鉴定出供试菌株的种类 ,并将其鉴定为G.cingulata f.sp.camelliae.该菌在新西兰、美国、澳大利亚等国家的其他植物上均有发现；李应祥等[29]在贵州茶园也分离到该种病原菌.

图3 基于β-Tub2、ITS、GPDH和ACT基因序列的多基因系统发育树Fig.3 Multi-gene phylogenetic tree based on combined Tub2 ,ITS ,GPDH and ACT gene sequences

研究表明 ,炭疽病菌存在明显的致病力分化现象[30－31].笔者于2012年对茶园炭疽病调查发现 ,茶树炭疽病害的田间症状具有多样性 ,有些茶园病害严重 ,有些茶园只发现少量的炭疽病叶.这种现象可能与茶树品种的抗性差异有关 ,或由致病菌的致病力差异引起 ,因此有必要对茶树炭疽病菌的致病力进行研究.本研究表明 ,不同菌株的致病力存在多样性 ,分析不同致病力菌株的基因序列发现 ,其ITS基因序列存在差异 ,其中致病力较强的ZRG菌的ITS序列与其余4株菌相比存在16个碱基变异 ,这可能与其致病性存在一定的联系.而多基因序列分析和形态学分析均支持它们是同种炭疽菌 ,只是出现了致病力的分化 ,是否是不同的生理小种还需进行深入研究.致病性测定表明 ,伤口是病原侵染的主要途径 ,因此在进行茶园耕作时应尽量减少茶树的机械损伤.另外 ,在培养过程中还发现 ,该类菌株纯培养3次后就不再产生分生孢子 ,这使该类病原菌的传播能力受到限制.因此 ,在茶园管理过程中应尽量避免将感染该病的枝叶带入茶园而造成病害的扩散.

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(责任编辑:杨郁霞)

Identification and pathogenic analysis of the pathogen causing tea plant(Camellia sinensis)anthracnose

LIU Wei1 ,2,YE Nai-xing1 ,3,LIU Wei3,JIN Shan1 ,3,LIAN Ling-li4,LAI Jian-dong1,XIE Yun-hai1

(1.College of Horticulture ,Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science in Universities of Fujian Province ,Fuzhou ,Fujian 350002 ,China；2.Tea Science Department ,Xinyang College of Agriculture and Forestry ,Xinyang ,Henan 464000 ,China；3.Institute of Tea Science and Technology and Economy；4.College of Life Science ,Fujian Agriculture and Forestry University ,Fuzhou ,Fujian 350002 ,China)

Five isolates(tentatively named ZRG ,YFS ,ZHD ,ABS and FHG)of anthracnose specimens from 4 counties of Fujian Province were amplified and inoculated into healthy leaves for pathogenicity test.Morphological analysis was conducted via pure cul-tivation ,conidium andappressorium observation and subsequent β-Tub2 ,ITS ,GPDH and ACT genes were sequenced to construct a multi-gene phylogenetic tree.Results showed that all the five pathogens ,which presented similar colony and morphological features ,were Gloeosporium cingulata f.sp.camelliae that causes anthracnose.All the healthy leaves were infected with anthracnose with leaf that inoculated with ZRG isolate posed the worst symptoms.This was in accordance with sequencing results that ITS of the other 4 strains were significantly different from that of ZRG.

tea plant(Camellia sinensis)；Colletotrichum；pathogen identification；virulent；multiple gene phylogenetic analysis

S435.711

A

1671-5470(2015)06-0581-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.004

2015－03－26

2015－05－23

国家自然科学基金项目(31270735)；福建省“2011协同创新中心”中国乌龙茶产业协同创新中心专项(闽教科〔2015〕75号)；福建省科技厅星火计划重点项目(2013S0065).

刘威(1985－) ,男 ,助教.研究方向:茶树栽培育种与质量安全.通讯作者叶乃兴(1963－) ,男 ,教授.研究方向:茶树栽培育种与资源利用.Email:ynxtea＠126.com.