RamR突变协同靶位基因突变对沙门氏菌耐药性影响的研究

付晓平 李嘉彬 蒋红霞

(广东科贸职业学院,广东广州 510430)

RamR突变协同靶位基因突变对沙门氏菌耐药性影响的研究

付晓平 李嘉彬 蒋红霞

(广东科贸职业学院,广东广州 510430)

从实验室保存的沙门菌中筛选出33株对环丙沙星呈现不同敏感程度的分离株,采用PCR方法检测喹诺酮类作用靶位基因突变和外排泵调控基因ramA的负调控蛋白编码基因ramR的突变。结果表明,33株沙门菌中,凡是高水平耐药菌和环丙沙星耐药菌株都发生GyrA和ParC的多位点突变,突变主要在gyrA和parC基因的QRDR,即GyrA发生83和87位的双突变(S83F/D87G,8株; S83F/D87N,5株;S83L/D87N,1株),ParC发生57和80位的双突变(T57S/S80R)。15株对环丙沙星敏感性下降的菌株中,有5株在gyrA83位发生单位点突变,有5株在87位发生氨基酸的取代(3株D87Y,2株D87N),其余4株在4个靶位基因的QRDR都没有发生任何突变。对33株沙门菌ramR扩增测序后发现,15株菌的ramR发生突变,共有4种突变类型,M83T(n=6),A37S(n=3),T18P (n=3)和氨基酸的缺失(n=3)。剩下的18株,无论对环丙沙星敏感/敏感性降低还是耐药,ramR没有检测到任何突变。

沙门氏菌;ramR;PCR;外排泵

沙门氏菌是引起人类食源性感染疾病最主要也是最常见的病原菌，而且沙门氏菌也是重要的人畜共患病病原体[1]，而在临床上治疗由沙门氏菌引起的感染时，氟喹诺酮类一般是首选药物，但由于临床药物的滥用或不合理添加使得沙门氏菌对抗生素的敏感性在不断下降[2]。沙门氏菌对喹诺酮类的耐药主要归因于喹诺酮决定区基因的突变，GyrA的突变是最常见的，而且突变通常发生在83位和87位，GyrA单位点的突变通常能够引起沙门氏菌对喹诺酮的敏感性下降，而ParC的突变通常伴随着GyrA的突变，且能够导致沙门氏菌对喹诺酮类药高水平耐药[3]。

除了由于氨基酸的替代导致突变引起沙门氏菌对药物的敏感性降低外，外排泵的作用机制也是也是一个不容忽视的重要原因[4，5]。在沙门氏菌中至少存在9种多重耐药外排泵，AcrABTolC是其中最重要的一种，它能够主动外排多种底物，包括抗生素、染料和洗涤剂等[6，7]。有研究报道，AcrAB-TolC对氟喹诺酮药物的主动外排作用是导致S.typhimurium DT204高水平耐药的主要原因，也是导致S.typhimuriumDT104多重耐药的主要作用机制[8]，RamA是沙门氏菌中诱导AcrAB-TolC表达的重要控制蛋白[9]。RamA表达受到负调控蛋白RamR的调控[10]。有研究报道当ramR基因发生突变或有插入序列时，RamR的功能发生改变，引起ramA的过表达或者表达量减少[8]，从而改变菌株的耐药表型。

本研究筛选了临床分离的对环丙沙星呈现不同耐药水平的沙门菌，探讨耐氟喹诺酮类沙门菌靶位突变类型与RamR突变类型之间的关联。

1 材料和方法

1.1 菌株

从实验保存的沙门氏菌中筛选了33株对环丙沙星呈现不同耐药水平的菌株，其中15株耐药株（MIC，4～128µg/ml），16株敏感性降低菌株（MIC，0.06～1µg/ml），敏感株2株，质控菌ATCC25922。各菌株耐药分子表型特征见表1。

1.2 靶位基因和ramR基因的突变检测

首先对菌株进行复苏，然后采用水煮法提取细菌的总DNA，备用，参考已发表相关文献设计、合成引物，对所有不同程度耐药水平的菌株采用PCR方法扩增靶位基因（gyrA、gyrB、parC和parE）和ramR基因。阳性PCR产物送北京华大公司测序，将测序结果提呈NCBI进行序列比对，分析靶位基因和ramR的突变情况。

2 结果

2.1 33株食品动物源沙门氏菌靶位基因QRDR突变检测

33株对环丙沙星呈现不同敏感性的沙门菌，靶位基因的突变主要发生在gyrA和parC基因。凡是对环丙沙星耐药的菌株（16株）都发生GyrA和ParC双靶位的多重突变，即GyrA发生83和87位的双突变（S83F/D87G，8株；S83F/D87N，5株；S83L/D87N，1株），ParC发生57和80位的双突变（T57S/S80R，11株）。而15株对环丙沙星敏感性下降的菌株中，有10株发生gyrA的单位点突变，其中有5株在83位发生S83Y（4株）和S83F（1株）突变，有5株在87位发生突变（3株D87Y，2株D87N）。有一株发生parCT57S的突变。4株在靶位基因的QRDR都没有发生任何突变，这些没有发生任何突变的菌株中，有三株携带PMQR基因。而2株对环丙沙星敏感的菌株，有一株发生gyrA靶位基因S83T的突变，且携带PMQR基因，一株在靶位基因未发生任何突变，也未携带PMQR基因。结果见表1。

2.2 ramR基因突变检测

分析33株不同程度耐药菌株ramR的突变情况发现，有15株菌ramR发生突变（8株高水平耐药，7株敏感性下降），共4种突变类型，M83T（n=6），A37S（n=3），T18P（n=3）和氨基酸的缺失（n=3）。剩下19株，无论对环丙沙星敏感/敏感性降低还是耐药，ramR没有检测到任何突变。结果见表1。

3 讨论

喹诺酮类药物为一类广谱高效的化学合成抗菌药，具有较强的抗菌活性，现已广泛用于人医临床和兽医治疗感染性疾病。近几年来，喹诺酮类药耐药株迅速增多，其临床疗效受到了严重的影响，喹诺酮类耐药机制复杂，主要有靶位改变和主动外排两个机制所致，这两者均有染色体突变引起[11]。与喹诺酮类耐药有关的gyrA的突变发生在QRDR第199-318个碱基，主要有4个突变位点，按照突变频率分别是83位，87位，81位和84位。且有研究已经证实QRDR的突变与细菌的耐药有直接的关系[12]。有研究证实gyrA的基本突变位点是Ser83，且此位点的突变常常造成细菌对喹诺酮类耐药[13]，拓扑异构酶Ⅳ的亚单位基因的突变也是造成耐药的一方面，其亚单位最主要的parC基因，parC和gyrA的N-末端都有与QRDR有关的区域，当发生氨基酸替代后影响药物与酶的结合，从而使得耐药性增加，但拓扑异构酶Ⅳ只是药物的从属靶位，parC的突变发生在Ser-80/Glu-84，并且gyrA的突变是引起细菌对喹诺酮类耐药的主要原因，而parC的突变则可引起菌株对氟喹诺酮类药的高水平耐药[14]）。

本研究对33株沙门菌的靶位基因突变检测证实了以前的研究结果，即gyrA是药物作用的首要靶位，也是细菌产生耐药性的第一步。在本研究中，有10株菌株发生gyrA单位点突变，导致细菌对环丙沙星的敏感性降低（MIC 0.06～1µg/ml），而gyrA和parC同时发生突变的菌株则对环丙沙星呈现高水平耐药。

本研究进一步分析RamR四种突变类型与靶位基因突变机制之间的关系。RamR发生A37S突变的菌株，GyrA和ParC都发生多位点双突变，对环丙沙星高水平耐药；而M83T类型的突变株的大多表现出明显增强的外排泵活性，其中5株在GyrA发生单位点的突变（2株在83位突变，3株在87位突变），只对环丙沙星表现出敏感性降低；另外有一株在GyrA和ParC都发生突变，对环丙沙星却表现高水平耐药（MIC 32µg/ml）。进一步检查6株M83T突变类型的菌株，当靶位基因发生双位点突变时，导致该菌株对环丙沙星高水平耐药。T18P类型的突变株中，2株GyrA和ParC均未发生突变，对环丙沙星敏感性下降。而RamR发生氨基酸缺失的菌株，其靶位都发生双位点突变，对环丙沙星高水平耐药。从我们的研究结果可以看出，细菌获得对环丙沙星的耐药性，主要以双靶位基因突变为主；然而不同ramR突变类型可能与靶位基因突变有协同作用。如M83T突变类型，当gyrA只发生单位点突变时菌株对环丙沙星仅表现敏感性降低，而当存在双靶位突变时，ramR发生M83T突变，使得菌株对环丙沙星高水平耐药。孙亚伟分析了实验室诱导的靶位基因首次突变的诱导株其ramA表达的情况，结果显示ramA表达增高能促进靶位基因的突变，使细菌获得高水平耐药。因此细菌获得环丙沙星的耐药性应该是两种机制协同作用的结果。

表1 各菌株耐药分子表型特征及靶位基因和ramR基因的突变情况

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