海带中岩藻多糖的抗衰老活性及构效关系研究

李小蓉,张 拴

(陕西中医学院药学院,陕西咸阳 712046)

海带中岩藻多糖的抗衰老活性及构效关系研究

李小蓉,张 拴

(陕西中医学院药学院,陕西咸阳 712046)

研究海带中岩藻多糖的抗衰老活性及构效关系。将海带中岩藻多糖(FSP)经分离纯化得到三个FSP分离组分(FSP-1、FSP-2、FSP-3),对3个组分进行了元素分析并分别测定各组分分子量及其单糖组成;通过对D-半乳糖致衰老的小鼠给药,并测定一些与衰老相关的生化指标,以研究海带中3个分离组分的抗衰老活性。结果表明 FSP-1、FSP-2、FSP-3治疗组与模型组比较,FSP-2与FSP-3均使衰老小鼠胸腺指数与脾脏指数明显回升(p<0. 01),且FSP-3作用效果更为明显。3个组分均能显著升高小鼠血清中超氧化物歧化酶活性,降低丙二醛含量,以及升高全血中谷胱甘肽过氧化物酶活性(p<0. 05或p<0. 01)。说明FSP中3个组分均具有抗衰老活性,各分离组分的抗衰老活性强弱与其硫酸基含量、分子量大小和单糖构成有关。

海带,岩藻多糖,抗衰老活性,构效关系

藻类是海洋生物活性物质的重要来源,已发现的海洋生物活性物质中约40%来自藻类[1]。我国沿海海域有丰富的海带资源,其药用价值早在《本草纲目》等古医书中已有记载。海带中多糖主要为岩藻多糖,研究表明,海带所含的岩藻多糖具有明显的生理活性,如抗肿瘤、促进造血功能等[2-3]。随着人们对岩藻多糖的深入研究,得知其并非单一结构的化合物,其组成十分复杂,称为含岩藻糖的硫酸多糖(fucose-containing sulfated polysaccharides,FSP)。由于岩藻多糖的含量和结构受多种因素影响[4],目前国内外的报道对其结构组成没有统一的定义,大多是对其进行初步纯化[5],得到岩藻多糖的混合物。国外Maria I. Bilan等[6-8]学者对岩藻多糖的结构进行了研究,而海带的深度开发空间还很大。

本实验采用阴离子交换纤维素色谱法和凝胶柱色谱法对FSP进行反复分离纯化,得到3个不同组分,比较三者体内抗衰老活性实验,并对各分离组分的抗衰老活性与分子量大小,硫酸基含量及单糖组成之间的关系进行了研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

海带(LaminariajaponicaAresch) 产于山东威海市,经鉴定为海带叶片;昆明清洁级小鼠 120只,许可证号:SCXK 豫 20050001,>2月龄,体重(20.0±2.0)g,雌雄各一半;D-半乳糖 张家港思普生化有限公司;超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒、丙二醛试剂盒 北京拜尔迪生物技术有限公司。

BS-100N自动部分收集器、BT100N数显恒流泵 上海青浦沪西仪器厂;CR22G Ⅱ离心机 日本日立公司;N-1100V-W/WD旋转蒸发仪 日本Eyela公司;GC-2410气相色谱仪 日本岛津公司;vario EL元素分析仪 德国Elementar Analysensysteme公司;GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪 日本岛津SHIMADZU公司;NEXUS 670傅里叶变换红外光谱仪 美国Nicolet公司;冷冻干燥机 美国Labconco公司;电子分析天平 德国Sartorius公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 岩藻多糖的提取 日晒干燥的海带经粉碎过筛后,95%乙醇回流脱脂1 h。10倍水量60 ℃下提取2次,时间分别为2、1 h。合并两次提取液,然后浓缩成一定体积。将浓缩液用浓度为95%乙醇进行沉淀,过滤,沉淀为岩藻多糖粗品(FSP),再用丙酮洗涤2～3次,Sevage法脱蛋白,双氧水法除去色素。

1.2.2 岩藻多糖的分离纯化 取一定量经脱色的岩藻多糖(FSP),用蒸馏水溶解后,过DEAE-52柱色谱(2.6 cm×70 cm),分别用含0、0.1、0.3 mol·L-13种不同浓度氯化钠水溶液进行洗脱,流速为1.0 mL/min,苯酚-硫酸法在480 nm处检测吸光度值,得到3种组分。这3个组分分别再经Sephadex G-100柱色谱(2.6 cm×90 cm),蒸馏水洗脱,最终得到FSP-1、FSP-2、FSP-3共3个组分。

1.2.3 FSP中3个组分的纯度鉴定 纯度鉴定采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)。色谱柱:TSK色谱柱,流动相:超纯水,流速:1 mL·min-1,柱温:35 ℃,示差折光检测器温度:30 ℃。

1.2.4 FSP中3个组分的元素分析 分别对FSP中3个组分中碳(C),氢(H),氧(O),氮(N),硫(S)进行分析。硫酸酯基(OSO2Na,sodium salt)按公式进行计算:硫酸酯含量(%)=3.22×S%。

1.2.5 GPC-MALLS联用技术测定FSP中3个组分的分子量

1.2.5.1 色谱分析条件 采用TSK系列凝胶色谱柱,流动相为0.2 mol·L-1NaNO3溶液,流速为0.8 mL·min-1,柱温:40 ℃;MALLS的光源气体为氦气和氖气,波长:690.35 nm。流动相的折光指数取1.350,3个组分在溶液中的折光指数增量(dn/dc)测得值均近似为0.147,校准激光的仪器常数为7.9074×10-6(V cm)-1,校准示差折光检测器仪器常数为2.1403×10-4(V cm)-1。

1.2.5.2 样品溶液的制备 精密称取纯化组分FSP-1、FSP-2、FSP-3,采用0.2 mol·L-1NaNO3溶液配制成6 mg·mL-1溶液,经0.22 μm过虑膜过滤,凝胶渗透色谱-激光光散射联用技术(GPC-MALLS)分析。

1.2.6 FSP中3个组分的单糖组成

1.2.6.1 标准单糖糖腈乙酸酯衍生物的制备 分别称取葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)各7 mg,加入10 mg盐酸羟胺,再加0.5 mL吡啶,90 ℃反应30 min,冷至室温,加入0.5 mL醋酸酐,90 ℃继续加热乙酰化,冷却后加入1 mL水和1 mL氯仿萃取3次,取氯仿层,挥干,残渣加1 mL氯仿溶解摇匀,即得标准单糖衍生物。

课堂教学中，教师要把握好“放”与“收”的度。教师对“放”与“收”的灵活把握，不仅依赖于教师的“才气自华”“腹有诗书”，还依赖于教师镇定自若、指挥若定的心态，而且对这个度的把握还必须符合学生的年龄层次、心理特点和知识水平，符合教材内容、学生个性等具体情况。这时的教师，就像战场上指挥千军万马的将军，只有了解整个局势的变化，临危不乱，从容不迫，才可能赢得这场战斗的最终胜利。

1.2.6.2 多糖水解及糖腈乙酸酯衍生化 分别称取FSP-1、FSP-2、FSP-3各10 mg,加入2 moL·L-1三氟乙酸4 mL,121 ℃密闭水解2 h,减压蒸干,加入甲醇再蒸干,重复3次,以彻底除去过量的TFA。以后处理与标准单糖衍生物制备过程相同,分别进样标准单糖衍生物和多糖衍生物,GC分析。

1.2.6.3 气相色谱条件 程序升温:120 ℃下保持4 min,然后以5 ℃·min-1升至190 ℃,保持4 min,再以3 ℃·min-1升至210 ℃,保持10 min。进样口温度:210 ℃;检测器温度:240 ℃[9]。

1.2.7 FSP中3个组分的抗衰老作用的研究

1.2.7.1 给药 昆明小鼠共分为11组,除正常对照组外,衰老模型组和9个治疗组每只颈背部皮下注射50 g·L-1D-半乳糖0.5 mL进行造模,而正常对照组颈背部皮下注射相同剂量生理盐水。造模完成后,正常对照组和衰老模型组腹腔注射生理盐水0.5 mL;给予治疗组腹腔注射相应的剂量体质量0.5 mL的FSP组分溶液,连续一共6周。

1.2.7.2 实验指标测定 小鼠血中指标测定:血清中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量,小鼠全血中谷胱甘肽过氧化物酶的活力。6周过后,将小鼠麻醉再摘除眼球取血,一部分血样常规分离血清,在4 ℃条件下4000 r·min-1离心5 min,取上清液测定;另一部分全血待测;丙二醛含量,超氧化物歧化酶活性谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定严格按照试剂盒操作程序进行。

1.2.7.3 免疫器官指数的测定 6周过后,将小鼠称重并取下小鼠胸腺和脾脏,采用电子天平称质量,以脏器湿质量(mg·g-1)表示小鼠脾指数和胸腺指数。

1.2.7.4 评估标准 小鼠每天注射给药1次,6周后,用紫外可见分光光度计测定小鼠血清中超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量及检测小鼠全血中谷胱甘肽过氧化物酶活力。

1.2.7.6 统计学分析 数据采用SPSS10.0统计学软件处理,多组间差异的显著性检验使用方差分析,两组之间的比较则采用t检验。

2 结果与分析

2.1 岩藻多糖的分离纯化

岩藻多糖的分离纯化结果如图1所示。岩藻多糖用蒸馏水溶解后,过DEAE-52柱色谱,氯化钠水溶液进行洗脱,苯酚-硫酸法示踪监测,得到3种组分。这3个组分分别再经Sephadex G-100柱色谱,蒸馏水洗脱,最终得到FSP-1、FSP-2、FSP-3共3个组分。组分的纯度鉴定采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)。样品纯度一般通过峰型进行判断,通常情况下,如果在凝胶柱填料的排阻极限内,HPGFC谱中呈现窄的单一对称峰的多糖组分被认为是均一的多糖。FSP中3个组分,经HPGPC法检测,均呈单一对称尖峰,说明三者均为均一组分。

图1 FSP中3个组分的DEAE纤维柱层析结果Fig.1 Elution pattern of crude polysaccharides extractedfrom kelp on DEAE-cellulose column

2.2 FSP中3个组分的元素分析结果

FSP中3个组分的元素分析结果如表1所示。由表1可以看出,FSP中3个组分C,H,O的摩尔比均约为1∶2∶1,符合糖类元素组成及比例。根据硫酸酯含量计算公式得FSP-1、FSP-2、FSP-3中分别为硫酸基含量为12.35%、37.98%、51.19%。

表1 FSP中3个组分的元素分析(%)

天然生物大分子的化学组成、分子量以及分子链构象在阐释构效方面十分重要,SEC-MALLS作为一种测定高分子化合物分子量的绝对方法,非常简便,而且不需要任何标准品。由激光散射仪、示差折光检测器和紫外检测器检结果中可知FSP中3个组分为单一对称的尖峰,且经GPC-MALLS联用技术测定,FSP-1、FSP-2、FSP-3的重均分子量分别为8.7×104、1.5×105、1.2×105u。

2.3 FSP中3个组分的单糖组成结果分析

由图2～图5及表2可以看出,三个组分均以岩藻糖为主。FSP-2、FSP-3组分与FSP-1相比,具有鼠李糖、木糖、半乳糖,而相比于FSP-2,FSP-3组分,则具有较高含量的鼠李糖。

图2 混合单糖标准品的气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of the sugar standards注:1. 鼠李糖;2. 岩藻糖;3. 木糖;4. 甘露糖;5. 葡萄糖;6. 半乳糖;图3～图5同。

图4 FSP2的气相色谱图Fig.4 Gas chromatogram of FSP-2

图5 FSP3的气相色谱图Fig.5 Gas chromatogram of FSP-3

表3 FSP中3个组分对D-半乳糖致衰老小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响(x±s)

注:
注:t检验,与对照组比较,**p<0. 01;与模型组比较,ΔΔp<0. 01。

表4 FSP中3个组分对模型组小鼠血清超氧化物歧化酶、丙二醛及全血中谷胱甘肽过氧化物酶的影响(GSH-Px)(x±s)

注:
注:与对照组比较,p*<0. 05;与衰老模型组pΔ<0. 05,pΔΔ<0. 01。

2.4 FSP中3个组分的抗衰老作用

如表3所示,小鼠经连续皮下注射D-Gal 6周以后,胸腺指数和脾脏指数与对照组比较,有所下降,且均具有统计学意义。注射FSP-1、FSP-2与FSP-3均能使衰老小鼠胸腺指数与脾脏指数显著回升(p<0. 01),且均存在一定量效关系,而且,相比于FSP-1、FSP-2,FSP-3作用效果更为明显,尤以FSP-3高剂量组小鼠的胸腺与脾脏指数升高最为明显。

表2 FSP中3个组分的单糖种类及摩尔比

注:
注:-表示未检出。

如表4所示,衰老模型组与正常对照组相比较,小鼠血清中超氧化物歧化酶活性明显降低,丙二醛含量显著升高(p<0. 05),此结果证明衰老模型成功建立。FSP-1、FSP-2、FSP-3治疗组与模型组对比,小鼠血清中的超氧化物歧化酶活性均显著性地升高,丙二醛含量显著降低,而全血中谷胱甘肽过氧化物酶活性均显著升高(p<0. 05或p<0. 01)。

3 结论与讨论

衰老自由基学说由harman[9]提出,该理论阐明了机体内时刻会产生自由基,但同时又能有效的清除自由基,使体内自由基维持在正常水平。随着年龄的不断增长,这种平衡逐渐被打破,造成人体内自由基过剩。过多的自由基可与细胞膜中的类脂质发生过氧化反应,致使细胞膜的破坏,从而最终导致细胞死亡。同时脂质过氧化的终产物(如丙二醛)可与DNA蛋白质等物质结合,损伤细胞膜,从而引起神经系统的功能障碍。在抗衰老中药的研究中常用的动物模型方法有很多,其中D-Gal致小鼠亚急性衰老模型因其衰老变化明显,模型稳定,在抗衰老研究中得到广泛应用[10]。研究者们认为,D-Gal引起的代谢紊乱使人体内过氧化反应增强,从而引起致老化反应[11]。

本实验D-半乳糖致衰老小鼠行动迟缓,皮毛松散无光泽,体质量增加量明显下降,同时血清中超氧化物歧化酶活性显著降低,丙二醛水平明显升高,与有关报道的结论相符。本实验结果表明FSP中3个组分治疗组与衰老模型组比较,小鼠血清中超氧化物歧化酶活性均明显升高,丙二醛均含量明显降低,具有统计学意义。FSP中3个组分治疗组均能明显对抗D-半乳糖的致老化作用,使体内超氧化物歧化酶活性显著提高,丙二醛水平则明显下降,因而推测FSP中3个组分治疗组可能通过提高超氧化物歧化酶活性,增强其对自由基的清除能力,抑制脂质过氧化,降低丙二醛含量,从而减轻对机体组织的损伤以延缓衰老。另外,FSP中3个组分能够显著增加小鼠的脾脏指数与胸腺指数,表明它们对小鼠的免疫功能也有调节作用。

由于海带中岩藻多糖一般为硫酸酯化多糖,而硫酸酯化多糖种类繁多,结构具有复杂性和多样性,且结构又与生物活性密切相关,其活性受单糖组成、分子量的大小、硫酸基含量及连接位置、多糖的立体结构等多种因素的影响,从而呈现出生理活性的多样性。本实验对FSP中3个组分进行多步分离纯化,得到3个均一的岩藻多糖。结合体内抗衰老效果的差异,对具有不同生物活性的组分的分子量,硫酸基含量及单糖组成情况进行了初步分析,对D-半乳糖致衰老的小鼠,重均分子量为1.5×105u的FSP-2与重均分子量为1.2×105u的FSP-3具有较高的抗衰老作用,而且FSP-3的抗衰老效果更好,说明抗衰老作用与组分具有适当的分子量有关。从硫酸基含量上来看,含量最高的FSP-3,具有最强的抗衰老作用。从单糖组成来讲,与FSP-1相比,抗衰老作用较强的FSP-2与FSP-3中含有鼠李糖、木糖、半乳糖,具有较高的抗衰老效果,而相比于FSP-2,FSP-3中的鼠李糖含量更高,因此,在单糖组成上,表现出与活性一定的相关性,即鼠李糖、木糖、半乳糖与FSP的活性强弱密切相关,而且鼠李糖的含量相对越高,抗衰老效果相对越强。上述只是针对海带中岩藻多糖多糖对对D-半乳糖致衰老的小鼠抑制作用规律的一个初步观察结果,为揭示其构效关系,还需要从更为详尽的一级结构和高级结构上进行大量的实验来进行解析。

[1]陈来照,马景鑑. 神经肽Y及其受体在实验大鼠垂体腺肿瘤中的表达[J]. 中华神经外科杂志,2007,23(12):949-952.

[2]谭周进,谢达平. 多糖的研究进展[J]. 食品科技,2003(3):10-12.

[3]CHANG Huxue,LEI Chen,ZHAO Jieli,et al. Antioxidative activities of low molecular fucoidans from kelp laminaria japonica[J]. Developments in Food Science,2004,42:139-145.

[4]李波,许时婴. 羊栖菜中褐藻糖胶的提取纯化研究[J]. 食品工业,2004(2):40-42.

[5]Maria I B,Alexey A G,Nadezhda E U,et al. Structure of a fucoidan from the brown seawed Fucus evanescens[J]. Carbohydrate Research,2002,337(8):719-730.

[6]Bilan M J,Crachev A A,Shashkow A S. Structure of a fucoidan from the brown seswees Fucus Serratus L[J]. Carbohydrate Research,2006,341:238-245.

[7]Bilan M J,Crachev A A,Shashkow A S,et al. A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L[J]. Carbohydrate Research,2004,339:511-517.

[8]Chevolot L,Mulloy B,Ratiskol J,et al. A disaccharide repeat unit is the major structure in fucoidans from two species of brown algaee[J].Carbohydrate Research,2001,330:529-535.

[9]Harman D. Aging:-A theory based on free radical and raditon chemistry[J]. J Gerontol,1956,11:298-299

[10]张熙,李文彬,张炳烈.D-半乳糖亚急性中毒大鼠拟衰老生化变化[J]. 中国药理学与毒理学杂志,1990,4(4):309-310.

[11]Hayakaws M,Hattorit,Sugiyama S,et al. Age-associatied Oxygen Damage and M utaition in Minchondrial DNA in Human Hearts[J]. Biochem Boiphys Res Commun 1992:189(2):979-985.

Study on the effect of anti-aging and structure-function relationship of fucoidan from kelp

LI Xiao-rong,ZHANG Shuan

(College of Pharmacy,Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046,China)

The effect of anti-aging and structure-function relationship of fucoidan from kelp was studied. The fucoidan was extracted from kelp and FSP-1,FSP-2,FSP-3 were purified. Elemental analysis,gel permeation chromatography coupled with multi-angle laser light scattering(GPC-MALLS)and GC analysis were applied to investigate the three components. In order to study the effect of anti-aging of three components from kelp,administered medicine was given to rats with subacute senile model by D-galactose,then some indexes were determined. Compared treatment group with senile model group,indexes of thymus and spleen(p<0.01)were promoted by FSP-2 and FSP-3,moreover,the effect of FSP-3 was more significant than FSP-2. The activity of superoxide dismutase(SOD)and GSH-PX in blood were significantly promoted,but the content of malondialdehyde(MDA)was decreased by three components from kelp. Three components from kelp had the activity of anti-aging,and the activity of anti-aging was in relation with the content of sulfate groups,molecular mass and sugar composition of them.

kelp;fucoidan;anti-aging activity;structure-function relationship

2014-06-25

李小蓉(1979-)，女，硕士，讲师，主要从事中药有效成分的化学研究工作，E-mail:lxmaill1979@126.com

TS201.2

A

1002-0306(2015)15-0117-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.017